Mesophyll porosity is modulated by the presence of functional stomata

Wheat stomatal size and density changes with ploidy

気孔の特性が小麦の倍数性レベルによって異なるかどうかを調べるために、2倍体（2n）の2種（Triticum baeoticum and T. urartu）と4倍体（4n）の2種（T. araraticum T. dicoccoides）、および6倍体（6n）のTestestidesの3つの品種で、気孔のサイズとパターンを調べた。 urartu）、4倍体（4n）の2種（T. araraticum、T. dicoccoides）、および6倍体（6n）のT. aestivumの3品種（cv. Cougar、Crusoe、Shango）の気孔の大きさとパターンを調べた。 これらの小麦種では、イネ科植物に特徴的な気孔が見られ、気孔複合体（それぞれが補助細胞に挟まれた一対のガード細胞で構成されている）が葉の表面に沿って表皮細胞のファイルに横たわっている。 図1a-cに異なる倍数性の背景における気孔の全体的な分布を、図1d-fに個々の気孔複合体の高解像度画像を示した。 これらの画像から、コムギでは葉の気孔の大きさと密度が二倍体の影響を受けていることが示唆される。 これらのパラメータを測定し、統計解析（ANOVA with posthoc Tukey）を行ったところ、6倍体品種の気孔複合体は、4倍体品種（P < 0.001）および2倍体品種（P < 0.001）の気孔複合体よりも幅が広く、それ自体は区別できなかった（P = 0.115; Fig. 1g）。 一方、気孔複合体の長さは、4倍体の系統と6倍体の系統で区別がつかなかった（ANOVA with posthoc Tukey, P = 0.479）、2倍体コムギでは4倍体（P < 0.001）と6倍体（P < 0.001；図1i）よりも気孔が有意に短かった。 このように、気孔複合体の面積は気孔の長さと幅の両方に依存しているため、3つの倍数体背景の間でこれらのパラメータが段階的に異なると、各倍数体レベルで気孔の大きさが異なることになる（ANOVA with posthoc Tukey, diploid/tetraploid P < 0.001; 四倍体/六倍体 P < 0.001）。) 気孔複合体は、2倍体の品種では最小、6倍体の品種では最大、4倍体の品種では中間であった（図1h）。 図1iに示した気孔複合体の長さの段階的な増加は、気孔密度にも反映されており（図1j）、二倍体種の気孔密度は四倍体種よりも明らかに高かった（ANOVA with posthoc Tukey, P < 0.001）と6倍体種（P < 0.001）（気孔密度では区別できなかった；P = 0.616）。 我々のデータは、現代の6倍体コムギの複雑な家畜化の間に、より大きいが相対的に少ない気孔を持つ葉への間接的な選択があったことを示唆している。 この選択は段階的に行われたようで、4倍体は2倍体と異なり、同程度の幅でより長く、より密度の低い気孔を持ち、6倍体の現代パン用小麦品種は4倍体の野生の親戚よりも広い気孔群を持っている。

メソフィルの空隙と気孔のパターニングは協調している

観察された気孔の特性のばらつきとメソフィルのパターニングとの間の潜在的な関係を調べるために、高解像度のマイクロCT画像解析を用いて、上記の気孔の特性評価に用いたのと同じコムギの系統でメソフィルの空隙と表面積を定量化した。 T. urartu、T. araraticum、T. aestivum cv Cougarの例示画像を図2に示す。葉の断片を3次元的に再構成し（図2a-c）、例示の横断面（図2d-f）、縦断面（図2g-i）、傍線部（図2j-l）では、空隙を黄色、細胞物質を緑色で表現している。 分析した他のコムギ系統の同等の画像を補足図1に示す。 これらの図から、すべてのコムギの葉は、古典的なイネ科植物の葉の構造を示しており、葉の長手方向に沿った平行な葉脈が、葉肉組織の境界を形成していることがわかる。 また、図2j-lに示す断面図からは、空洞の大きさ、分布、全体の量が小麦種によって異なることがわかる。 MicroCTでは、これらの違いを単に2次元の断面ではなく、組織の3次元的な深さにわたって定量化することができます。 葉のアディキシャル（上）からアアキシャル（下）にかけての組織の空隙率（組織の総体積に占める空隙の体積の割合）を分析したところ、空隙の量と分布に共通点と相違点が見られた。 すべての種で、表皮から離れるほど空隙率が高くなり、葉の中央部では比較的高い空隙率のプラトーが見られた（図2m-o）。 葉の中の距離に応じた空隙率の増加率は、2倍体の種で最も大きく（Fig.2m）、6倍体の種では空隙率の勾配が浅く（Fig.2o）、一般的に最大空隙率の値は2倍体の種で観察された値よりも低くなっていた。 四倍体の種は、葉の深さ全体で中間的な空隙率のパターンを示した（Fig.2n）。 二倍体と四倍体の野生種から六倍体のコムギが進化する過程で、葉の中の空隙と組織の分布の基本的なパターンは保存されてきましたが、直接的または間接的に、空隙率の低い葉の構造（すなわち、葉肉が密集している）が選択されてきたことを示唆しています。

ガス交換は空域と気孔のパターニングを反映している

これらのコムギ近縁種に表されている多様性を利用して、私たちは次のような研究を行いました。 水蒸気に対する気孔コンダクタンス(gs)と最大気孔コンダクタンス(gsmax)を測定することで、気孔のサイズ/密度とメソフィルの空隙の傾向がガス交換に及ぼす影響を調べました。 これらのデータから、メソフィル空隙率とgsの間には顕著な正の相関関係があることがわかった（r2 = 0.915, P = 0.0007; Fig.1l）。2倍体の葉はgsが高く空隙率が高く、6倍体の葉はgsが低く空隙率が低いことがわかった（Fig.1k）。 このような葉肉の空隙率とgsの強い相関関係は、分析した様々な系統の個々の複製植物のペアデータを考慮しても維持されていた（ピアソン相関、r2 = 0.451、P = 0.0001；補足図2）。 二倍体の増加に伴う多孔性の減少は、組織体積あたりの露出した葉肉表面積の減少にもつながり、その結果、gsとこのパラメータには強い正の相関が見られた（Pearson correlation, r2 = 0.718, P = 0.016; Supplementary Fig.3a）。これは、露出した葉肉表面積を葉面積あたりで表した場合にも見られた（Pearson correlation, r2 = 0.633, P = 0.0323; Supplementary Fig.3b）。 gsmax（補足図3eに示す測定値を用いて算出）と空隙率の関係は、gs（図1l）で観察されたものよりも弱かった（Pearson相関、r2 = 0.487、P = 0.081；補足図3c）。 gsmaxと気孔面積を解析したところ、逆相関が見られた（Pearson correlation, r2 = 0.613, P = 0.037）（Supplementary Fig.3d）。これは、気孔の大きさと密度がgsに複雑なトレードオフをもたらしていることを示す過去の研究結果と一致する。

気孔とメソフィル空隙の関係

以上の解析結果は、気孔の分化とメソフィル空隙の形成の因果関係を証明するものではありませんが、一致しています。 この仮説を検証するために、私たちは気孔の特性を変化させた一連のコムギのトランスジェニック系統を使用しました。 気孔パターニングは、一連の移動性ペプチドシグナルである表皮パターニング因子（EPF）22,23,24を介して制御されていることが明らかになっており、これは、気孔密度を変化させ、その結果、メソフィル分化に及ぼす影響を調べるための有効な手段となる7。 EPF1またはその近縁種であるEPF2をシロイヌナズナで過剰発現させると、気孔密度が低下することが示されており25、最近ではコムギの同族遺伝子（TaEPF1）を過剰発現させると、同様の表現型になることが示されている26。

TaEPF1-OE株の共焦点画像を見ると、気孔を形成する表皮ファイルの一部の細胞は、気孔形成の初期イベントを経たものの、気孔複合体と孔を生成する最終的な分裂プロセスを経ることができなかったようである（図3a）。 これらの異常な気孔前駆細胞の直下にある葉肉細胞には、細胞分離の兆候は見られなかったが、成熟した気孔には明確な気孔下の空洞が見られた（図3b、c）。 気孔下の空洞の有無を数えてみると、TaEPF1-OEコムギ系統では、中止された気孔系細胞の下に空洞が全くないことが確認されたが、分化した気孔はすべて空洞に覆われていた（図3h）。 また，TaEPF1-OEの葉のマイクロCTイメージングでは，WTに比べて気孔下の空洞がなく（図3d，e），葉肉の密度が高いことも明らかになった（図3f，g）。 葉の構造を定量化すると、TaEPF1-OEの葉は確かにWTに比べて空隙率が低いことがわかった（Fig.3i）。

表皮下細胞の分離と気孔分化のイベントとの関連性をさらに調査するために、私たちは、表皮下細胞が長いことに着目しました。 これは、イネ科植物の葉の縦軸が組織分化の発達勾配をもたらすという事実を利用したもので、近位の基部にある細胞が分裂を経て、より遠位の先端領域で気孔の形成を含む多くの発達経路に入る細胞を生み出すというものです23。 コントロール系統（トランスジェニックTaEPF1-OE植物の形質転換していない親）の解析では、成熟した葉5の先端部、中央部、基部で観察された領域において、気孔密度の勾配は見られなかった（補足図4a）。 しかし，TaEPF1-OE株の葉を同様に解析したところ，5枚目の葉の基部では気孔密度が低下していることが分かり（補足図4b），これはCT解析で明らかになったように，この領域では気孔率が低下していることに反映されていた（補足図4c）。 さらに、コムギの葉の付け根にある、気孔分化が始まったばかりの領域を特定するために、共焦点顕微鏡を用いて、発育の比較的早い段階にあるコムギの葉3を分析した。 その結果、葉の先端部分では、成熟した気孔複合体（図4a）とそれを取り巻く比較的大きな空隙（図4b、c）があることがわかった。 対照的に、より近位の基部では、気孔分化に特徴的な分裂パターンを持つ表皮細胞がはっきりと見られ（図4d）、隣接するいくつかの表皮下細胞の間に時折空洞が見られたが（図4e）、これらはいずれもより近位の組織で観察されたものよりもはるかに小さく（図4b）、空洞は見られなかった。

これらの結果は、表皮下のメソフィルでは内因性の発達プログラムの一部として細胞分離が起こるが、最終的に形成される空洞の大きさと分布は、隣接する分化した気孔の存在によって促進されるという仮説を支持するものである。

これらの変化の潜在的な生理学的要因を調べるために、異なるプロイディレベルのコムギ系統の光合成同化率、CO2に対するメソフィラコンダクタンス(gm)、および瞬間的な水利用効率(iWUE)を比較した。 その結果、同化率（補足図5a）やgm（補足図5c）には二倍体レベルとの明確な関係は見られず、同化率とメソフィル空隙率との明らかな相関も見られなかった（補足図5e）。 一方、6n系統のコムギは、2n系統および4n系統のコムギよりもiWUEが有意に高かった（補足図5b；ANOVA with posthoc Tukey, P = 0.0005 and P = 0.013, each）。 これは、CT解析で得られた体積当たりのメソフィル表面積の減少を反映しており（補足図5d）、6n系統は2n系統に比べて有意に低い値を示した（ANOVA with posthoc Tukey, P = 0.0001）。 興味深いことに、共焦点顕微鏡で葉肉細胞の体積を測定したところ、倍数性のレベルに応じて明らかに増加していた（補足図5f）。 これらのデータは、表面積と体積の関係が類似していることを考慮すると、現代の小麦が選抜される過程で、メソフィラ細胞のサイズが大きくなり、それに伴って露出表面積が減少し、メソフィラの空隙率が低下したという仮説に合致する。また、サイズの増加と密度の低下という気孔パラメータの変化も見られる。

気孔の分化とメソフィラ空隙の形成との間の潜在的な因果関係を調べるために、我々は分析対象をウデ科植物に変え、以前に気孔密度27が変化していることが明らかになった一連のシロイヌナズナのトランスジェニック系統を対象に、microCTとガス交換を組み合わせた分析を行った。 EPF2を過剰に発現させると、気孔密度が著しく低くなる系統（EPF2OE）と、EPF2とその相同遺伝子（EPF1）を欠損させると、気孔密度が著しく高くなる系統（epf1epf2変異体）に注目した25。

シロイヌナズナに見られるウドンコ病の葉は、典型的な単子葉（この論文では小麦が例示されています）とは異なり、特徴的に2つのメソフィル領域、すなわちアディキシャル・パリセード層とアディキシャル・スポンジー層が見られ、これらは細胞の形状と空隙（多孔性）に発生学的に設定された違いがあることで区別されます13。 シロイヌナズナ系統の葉の中で興味のある部分を選択することで、それぞれのパリセード層とスポンジ層の異なる空隙率のデータを得ることができた。 メソフィル全体の空隙率の平均値を比較すると、系統間の差はあまり見られないが、これは主にスポンジ状のメソフィル空隙率の値が類似していることを反映している（補足図6）。 一方、パリセードのメソフィラ空隙率（海綿状メソフィラ空隙率よりも光合成効率との関連性が高い13）は系統間で大きな差があり、epf1epf2のパリセードは空隙率が最も高く（図4j）、気孔密度も最も高かった（図4i）。 これらのデータは、単子葉の小麦の葉と比較して、真子葉のシロイヌナズナの葉ではより複雑な状況にあることを示唆している。 シロイヌナズナでは、気孔密度を変化させる操作を行うと、メソフィラの多孔性が明らかに変化するが、その結果はメソフィラの種類（パリセード、スポンジー）によって決まるという。 この観察結果は、葉の発生のごく初期にメソフィラの分化パターンが設定され（真正植物ではpalisade層とspongy層が定義されている）28,29、メソフィラのアイデンティティが、気孔パターニングに関連するシグナルなど、発生の後期に発生する因子による空隙率の調節の規模を決定するという解釈に合致する。 さらに、コムギと同様に、気孔分化の初期段階を分析した結果、メソフィル空隙の形成の程度と範囲は、成熟して分化した気孔の存在によって調節されるという考えが裏付けられた。 すなわち、表皮細胞が分裂して気孔が形成される葉の成長段階（図4j）では、いくつかの表皮下細胞の間隙に空隙が見られたが（図4k）、これらの空隙のパターンとその上にある分化した気孔との間に明らかな類似性は見られなかった（図4l）。 完全に分化した気孔が見えるようになった段階（図4g）では、表皮下のパリセードメソフィル全体に多数の大きな空洞があり（図4h）、気孔は常に空洞に支えられていた（図4i）。

気孔コンダクタンスとメソフィラ空隙の調節

コムギとシロイヌナズナのデータは、気孔の存在がメソフィラの空隙の程度を調節するという仮説を支持するものである。 しかし、シロイヌナズナのEPF2OE系統では、気孔密度が大幅に減少しているにもかかわらず（図5i）、パリセードの空隙率がCol-0と変わらないことから（図5j）、（これまでに示唆されているように）ガード細胞の分化がメソフィル細胞の分離を比例的に増加／減少させるという単純に直接的なプロセスではないことが示唆された。 もう一つの仮説は、ガス交換を可能にする気孔の実際の機能が、気孔密度とメソフィルの多孔性を結びつける主要な要因であるというものである。 実際、我々の小麦のデータでは、メソフィルの空隙率とgsの間に強い正の相関が見られた（図1l、3i、j）。 この仮説をシロイヌナズナで検証するために、最近明らかになった気孔変異体focl1-1を用いた。 その結果、ほとんどの気孔が形成され、最初は脂質／クチクラ層で完全に覆われている。 成熟すると、約10％の気孔のクチクラが破れ、必然的に穴が開いて、目に見える気孔下の空洞を介して、葉の内外で限られた範囲のガス交換を行うことになる。 部分的に覆われたfocl1-1の気孔を図5gに示したが、Col-0、EPF2OE、epf1epf2の葉で観察された気孔の開き具合と比較することができる（図5e-h）。 部分的に覆われた気孔の存在は、メソフィラの多孔性がどの程度ガス交換に関係しているかを調べるための有用なツールとなる。 シロイヌナズナ4系統のmicroCTとガス交換を一対一で解析したところ、gsとパリセードの空隙率には非常に有意な正の相関が見られ（ピアソン相関、r2 = 0.471、P = 0.0002、図5l）、focl-1変異体のデータはCol-0対照体のデータよりも低く、EPF2OEのサンプルと同程度であった。 変異株の個々の葉の同化率をパリセードの空隙率と関連づけて考えると、弱い相関関係はあるものの（補足図7a；ピアソン相関、r2＝0.289、P＝0.007）、空隙率と水利用効率の関係ははるかに強い（補足図7b；ピアソン相関、r2＝0.526、P＝0.0001）。

これらの観察結果は、分化したガードセルからの潜在的な直接信号に加えて、ガス交換を可能にするための気孔の実際の機能が、最終的にメソフィルの多孔性を制御する細胞分離と成長のイベントを促進する上で、重要な機能的役割を果たしているという考えを支持しています。