Root Hair Sizer: an algorithm for high throughput recovery of different root hair and root developmental parameters

植物材料、培養条件、根の処理

本研究に用いたMedicago truncatula-R108の野生型苗は、2008年にフランスのINRA-Montpellierで収穫されたもので、水分を減らすために親水性の綿で空洞を埋めたチューブの中で-20℃で保存されていた。 種子はサンドペーパー（グリットP80）を用いてわずかに傷をつけた後，市販の漂白剤1/4錠を250 mLの水に溶かし，30 µLの洗剤を加えた溶液中で30分間撹拌しながら表面殺菌を行った。 その後，滅菌水で3回，層流下で種子を徹底的に洗浄した。 洗剤がまだ残っている場合は，さらに洗浄を行った。 最後の洗浄の後，種子を室温の水中で1時間保持し，着床させた。 余分な水を取り除き，種子を水培地1%寒天（HP 696-Kalys）上にランダムに散布した。 プレートを逆さまにして4℃の暗所に置き、3～4日間の成層を行った。 最終的には、プレートを逆さまにして、暗闇の中、室温で一晩かけて発芽させた。これは、寒天の外側でまっすぐに根が伸びるようにするためであり、さらに新しい培地に移しやすくするためでもある。 その後、苗を1.3%の寒天（HP696-Kalys）で固めた改良ファーレウス培地で培養した（modified Fahraeus medium: CaCl2 1mM、MgSO4 0.5mM、KH2PO4 0.7mM、Na2HPO4 0.8mM、Fe EDTA 50μM、以下の各微量元素0.1mg/L。 MnSO4, CuSO4, ZnSO4, H3BO3 et Na2MoO4, KOHでpHを7.5に調整）。 培養液を入れた正方形のペトリ皿（12cm×12cm）に、根が貫通しないように不活性吸収紙（Mega International-USA）を敷いて、根が1cm程度の苗を最大8本移植した。 移送の際には、乾燥を防ぐために125μLの滅菌Milli-Q水を各根に加えた後、ミリポアテープで箱を閉じた。 また、根を光から守るために、黒いポケットでディッシュの底部を覆った。

RHSアルゴリズムをテストするために、根をさまざまな処理にかけました。

RHSアルゴリズムを検証するために、根を異なる処理に付した。最初の無処理の植物は、移植後3日間培養した後、根を顕微鏡で撮影した。 処理条件は、移植2日後にディッシュを開いて水平に置き、10nMのNodファクター（NF）または10μMのインドール-3-酢酸（IAA）を滅菌したMilli-Q水で希釈した処理液を20mL加えた。 対照として，植物は滅菌したMilli-Qで処理した。

Arabidopsis thaliana (Col0)の種子は，37%の塩酸3 mLと10%の次亜塩素酸ナトリウム50 mLを混合して発生させた塩素ガスで3時間表面殺菌した。 種子は、0.8%のPlant agar（Duchefa）を用いてゼリー化した1/2MS培地を詰めた角皿（12cm×12cm）に撒いた。 皿は、層状化のために4℃の暗所で2日間保存し、その後、発芽および培養のために21℃で16時間照明した。

Brachypodium distachyon (Bd21-3)の種子を鉗子で殻から剥き、1mLの殺菌バッファー（20%家庭用漂白剤、0.1%Tween20）の中でロッカーの上で15分間殺菌した後、二重蒸留水で4回すすいだ。 種子の長軸の胚極が下向きになるように、1%寒天を添加した1/2MSを入れた角皿（12cm×12cm）に種子を沈めた。 4℃で2日間成育させた後、ディッシュを移し、28℃で16時間の照明を施したグロースチャンバーに垂直に置き、発芽させた。

画像の取得

方法のさまざまなステップを詳しく説明する前に、画像処理、フィジースクリプト解析、データソート、シグモイドフィットを含むプロセス全体のパイプラインをAdditional file 2にまとめています。

生育室に移してから3日後（つまり、必要に応じて特定の処理を行ってから18時間後）に、根を地上部から切り取り、液体ファハレウス培地の中でスライドとカバースリップの間に置いた。 明視野顕微鏡（ライカDMI6000、電動ステージx、y、z、LASソフトウェア、ハロゲンライカランプ、0.15開口の5×ドライ対物レンズ、浜松オルカER-1395カメラ）を用いて、19,703ppiの解像度で画像を取得した。 RH幅は平均して10ピクセルでカバーされている。 顕微鏡の電動ステージとLASソフトウェアのモザイク再構成機能を用いて，分析したすべての画像を取得し再構成した（同様のツールはImageJとFijiで自由に利用できる）。 この選択は後にシグモイドモデルで標準化されるので、取得する根域の端を正確に選択する必要はない。

シロイヌナズナの根の明視野画像は、0.5×Nikon SHR Plan Apo WD:71対物レンズ、ズーム8、Hamamatsu C11440カメラを装備したNikon SMZ18実体鏡の下に、開いた培養箱を直接置いて、15,631ppiの解像度で取得した。 2つの連続した画像が重なるように、視野下のボックスを手動で動かして、1つのルートにつき3つのXY位置を取得した。

Brachypodiumの苗は、顕微鏡のスライドと水を張ったカバースリップの間で、葉がカバースリップから露出しないようにして撮影した。 画像はシロイヌナズナの苗と同じ光学系で取得し、最終的な倍率は40倍としました。 2枚の画像が重なるように、1つの根につき2つのXYポジションを取得した。

シロイヌナズナとBrachypodiumで取得したXY画像は、フィジーで2D Stitchingプラグインを使ってつなぎ合わせました。

シロイヌナズナとBrachypodiumで得られたXY画像は、フィジーで2D Stitchingプラグインを使用してつなぎ合わせました。

すべての画像処理はフィジーのオープンソースソフトウェアを使用して行われましたが、AnalyzeSkeletonとAuto_ThresholdプラグインをインストールしたImageJオープンソースソフトウェアでも行うことができます。 出発点として、すべてのRHに焦点を当てた単一の画像が必要です。

残りの処理は、Additional file 1: Script 1で利用可能なRHSアルゴリズムを実行することによって適用できる。

残りの処理は，Additional file 1: Script 1にあるRHSアルゴリズムを実行することで行うことができる。アルゴリズムの全ステップの概要は，Table 1にもあり，図2とAdditional file 2に示されている。 図S5。 また，インターフェースの理解を深めるために，Additional file 5: Movie 1も用意した． RHS処理の最初の部分は、RHs領域の検出である。 井上らに触発されたこの方法は、ピクセル強度の閾値処理からなる。 最初の処理では，RHsの輪郭を検出し，2番目の処理では，根の輪郭のみを処理する。 ピクセル強度のしきい値を手動で定義することを避けるために，自動化されたしきい値が使用された。 RHを伴う根の検出は，Bernsen法を用いて達成され，一方，根の軸のみの検出はPhansalkar法を用いて達成された（Additional file 2: Figure S7 and Table 1-step 3 and 4）。 生成された両方の2値画像を滑らかにして穴を埋めるために，ピクセルの拡張と侵食を数段階に分けて行った（表1-ステップ3.2と4.2）。 次に，根軸の画像を根全体の画像（RHのある根）から減算し（Additional file 2: Figure S7 and Table 1-step 5），RHだけで覆われた表面を得た。

以降のステップでは，根がまっすぐであることが求められるため，「Skeletonize」および「Analyse Skeleton (2D/3D)」コマンドを実行した後，根軸画像から得られたスケルトンの最長パスとしてルート・ミディアム・ライン（RML）を復元する（Additional file 2: Fig. S7 and Table 1-step 8.1 and 8.2）。 次に，RML画像をポリラインの選択範囲に変換し（ステップ8.3および8.4），フィジーの「Straighten」コマンドを用いて直線化する（Additional file 2: Fig. Straighten “はグレーレベルの画像を生成するので、追加の2値化を実施する（表1-ステップ11と12）。

Root Hair Sizer: RHの長さの測定

根元の髪の長さの測定は、「結果」のセクションで詳述したように、2つのステップで行われます（図2）。 第一に、直線化された二値化画像のRHの根元軸に沿って長方形の選択範囲をスライドさせ、各ステップで選択範囲内のRH表面の高さ “L “を式（1）で測定します（表1-ステップ14.1から14.3）。 次に，所定の数（典型的には10個）の連続した個々のL値をMaxフィルタリングして，RHの長さの推定値としてLmax値を得る（表1-ステップ14.4～14.5）。

Root Hair Sizer: adjustable settings

根の種類や取得した画像の特性によっては、いくつかの設定を調整する必要があるかもしれません。 調整可能なステップは、RHSスクリプトでいくつかのアスタリスクで強調されていますが、Medicagoの例で採用した設定は、表1に記載されています。 画像を閾値処理する際、BernsenおよびPhansalkarの閾値処理法の半径値は、異なる解像度の画像や、直後に適用される侵食および拡張の数などに合わせることができます。 根毛の形状や撮影に使用した光学機器の種類がここで紹介した例と大きく異なる場合は、ユーザーが自分の設定に合わせて閾値化戦略をカスタマイズすることをお勧めします。 例えば，シロイヌナズナの根では，RHの形状を検出するためにステップ3でベルンセン閾値の代わりにファンサルカー閾値を使用し，一方，根の形状を検出するためにステップ4でファンサルカー閾値の代わりにベルンセン閾値を使用した。 さらに，ステップ5はもはや必要ではなかった（Additional file 4: Script 4）。 また、根のスケルトン化のプロセスにも調整が必要かもしれません。 Skeletonize」と「Analyse Skeleton (2D/3D)」コマンドの後に得られる根元の中線を強調するポリラインの簡略化の量は、はるかに大きな画像や小さな画像に合わせて調整することができる。

RHSを実行する際に、ダイアログボックスで分析するルートセグメントを選択することができます。 走査選択の幅wは、1つのRHよりもわずかに薄くなるように調整することができます（1/2から2/3まで）。 最後に、Lmaxが選択されるべき間隔のサイズも適応させることができる。 Lmaxを収集するための10回の選択の間隔は、ここに示された例では正確に見えました。 RHプロファイルの「穴」などによるデータの変動に対して保持されるデータポイントの量を調整するこのパラメータを変化させた場合の効果は、Additional file 2に示されています。

Root Hair Sizerは、根のいくつかの部分を分析から取り除く必要がある場合、画像に注釈を付けることも提案しています。

Root Hair Sizerはまた、根の部分を分析から除外する必要がある場合、画像に注釈をつけることも提案しています。根に沿ったこれらのコメントの位置は、各データポイントに1と0（それぞれこのポイントでのコメントの有無）の注釈をつけて、最終的なテーブルに復元されます。 さらに、RHSでは、いくつかのステップで、アルゴリズムによる自動処理をユーザーが確認し、最終的には手動で修正することができます。 すべての自動定義と手動修正は、関心領域（ROI）として記録・保存されます。 RHSを初めて実行した後，Additional file 6: Script 2に示されているスクリプトを使用することで，元の画像に関連付けられたROIを使用しながら，ルートの別の領域を分析することができます． このスクリプトを実行するには、同じRML幅を使用し、最初のダイアログボックスに、メインのRHSアルゴリズムで使用したのと同じコメント名を入力することが重要です。

データ処理

RHSで収集したデータは、Excelスプレッドシートソフトウェアでソートされます。 すべての発表された結果について、アーティファクト (例えば、気泡やほこり) を示す領域は分析から削除されました。 一部の画像では、根の一方の側が他方の側に比べて長さ全体に渡って小さいRHを示しており、主に横に並んで成長している根の場合に見られます。 これらのケースでは，より長いRHを持つ側のみが分析のために保持された。 その他の特定のデータソートやパラメータは，図の凡例や本文で述べている。 結果」で述べたように、データポイントを正確にフィットさせるために、2回の連続したシグモイドフィットを行いました。 そして，図3b，Additional file 2.に示されているように，Fig:

データはSigmoidal curve ˶ˆ꒳ˆ˵ )

この最初のフィットにより、屈曲点d50_1と伸長長δ_1が得られます。

Sigmoidal adjustmentはGraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。 各画像から得られたデータは別々に処理した。 各画像のフィットの初期値を定義するために、以下のルールを用いて最小二乗フィットを適用しました。