この記事では、モノクロメーターによる 2 次回折の現象と、蛍光分光法で発生する問題について説明します。
この記事は、蛍光スペクトルを測定する際に発生する最も一般的なエラーや実験的なアーティファクトについて説明する一連のブログ記事 (最初のブログ記事を読む) の 2 番目の記事です。 このリストは、David M. Jameson著の素晴らしい本「Introduction to Fluorescence」に掲載されている「Rogue’s Gallery of Fluorescence Artefacts and Errors」にヒントを得たものです1。
Second Order Diffraction とは
蛍光分光法では、励起波長と発光波長を選択するためにモノクロメーターが使用されます。 一般的な蛍光分光器は、2つの分光器で構成されています。励起波長を選択する励起分光器と、検出器に到達する波長を選択する発光分光器です。
分光器は、広帯域の光から目的の波長を分離するために、回折格子を利用しています。
ここで、mは回折の次数です。 λは回折光の波長、dは回折格子の溝の間隔、θίは回折光と回折格子の法線の間の角度です。 一定の場合、各波長の光は異なる角度で回折され、モノクロメーターで目的の波長を分離することができることがわかります。 また、一定の場合と一定のλの場合は、正と負の整数値（…-2, -1, 0, 1, 2…）を取ることができる回折次数mに応じて、異なる角度で方程式が満たされることがわかります。 1の値は1次回折と呼ばれ、回折格子の法線に近い位置で発生し、強度が最も高くなります。 同様に、±2の値は2次回折と呼ばれ、より浅い角度で発生し、強度は弱くなります。
モノクロメーターでは、1次回折（+1または-1）のみが目的の波長を選択するのに使用され、それ以上の次数は不要です。
モノクロメーターでは、目的の波長を選択するために使われるのは1次回折（+1または-1）のみで、それ以上の次数は不要です。しかし、回折される波長が幅広いため、1次および2次回折が占める角度範囲は一意ではありません。 このことは、図1に示されているように、青い円錐は光が1次回折している角度の範囲を表し、赤い円錐は光が2次回折している角度の範囲を表し、これらの範囲の間には共有されるオーバーラップ領域がある。 この共有領域は、グレーティングの式からもわかります。 600nmの光を1次回折させた場合（m=1、λ=600nm）と、300nmの光を2次回折させた場合（m=2、λ=300）を考えてみると、回折格子の方程式の左辺はどちらも同じであり、回折光の角度も同じであることがわかります。
蛍光スペクトルにおける二次回折の出現
2次回折は、粉体、結晶、コロイド懸濁液などの散乱試料で特に問題となります。 2次回折が蛍光スペクトルに与える影響を示すために、蛍光色素2-アミノピリジンの溶液と、シリカナノ粒子のコロイド懸濁液であり散乱体として機能するLudoxを混合して、散乱蛍光サンプルを調製した。 この溶液を300 nmで励起し，発光分光器のオーダーソーティングフィルター（次項参照）を無効にした状態でFLS1000フォトルミネッセンス分光器を用いて，図2に示すように250 nmから950 nmの範囲で発光スペクトルを測定した。 続いて，1-アミノピリジンの1次蛍光が380nmにピークを示します。 その後、これらのピークは、600 nmのレイリー散乱ピークと760 nmの蛍光ピークを持つ2次アーチファクトとして繰り返される。 また、900 nmには弱い3次のレイリー散乱ピークが見られます。 2次のアーチファクトを真の蛍光発光と勘違いすることは、経験の浅い蛍光ユーザーにありがちなミスであり、文献に誤った報告がなされる原因にもなっています。 その一例として、よく知られているタンパク質残基の UV 発光に加えて、675 nm と 600 nm にトリプトファンとチロシンの弱い長波長の発光バンドを新たに報告した論文が発表されました3。
Order Sorting Filterによる2次回折の除去
2次アーチファクトを間違えて公開するのは極端な例ですが、より一般的な問題は、2次散乱が測定中の蛍光発光と重なり、スペクトルが歪んでしまうことです。 図3aは、図2と同じLudox / 2-aminopyridideサンプルの発光スペクトルですが、励起波長が240 nmにシフトし、発光範囲が狭くなっています。 2次散乱が480 nmにあり、2-アミノピリジンの蛍光のテールと重なっているため、スペクトルの正確な測定ができません。この問題を解決するには、モノクロメーター内にオーダーソーティングフィルターを使用します。 この問題を解決するために、モノクロメーター内にオーダー・ソーティング・フィルターを使用します。オーダー・ソーティング・フィルターは、フィルターのカットオフ波長以上の波長のみを透過させるロングパス・フィルターです。 モノクロメーター内のオーダー・ソーティング・フィルターの原理を図4に示します。オーダー・ソーティング・フィルターは、出射スリットの手前にあるフィルターホイールに取り付けられています。 モノクロメーターが300 nmを透過するように設定されている場合、300 nmの回折光がモノクロメーターの出口スリットに向かうように回折格子を回転させ、フィルターホイールを回転させると、光路にロングパスフィルターがなくなり、300 nmの光が希望通りにモノクロメーターから出力されます（左図）。 モノクロメーターが600nmの光を透過するように設定されている場合、回折格子が回転して、1次回折した600nmの光が出口スリットに導かれ、少量の2次回折した300nmの光が同伴されます。 フィルターホイールを回転させると、出口スリットの前に400nmのロングパスフィルターが配置され、不要な300nmの光を遮断しながら目的の600nmの光を透過させます（右図）。
並び替えフィルターの利点は、図3bに示されています。この図では、FLS1000のエミッションモノクロメーターの自動並び替えフィルターホイールを有効にして、スペクトルを再測定しています。 図3bは、FLS1000の発光分光器の自動オーダー・ソーティング・フィルター・ホイールを有効にしてスペクトルを再測定したものです。 エディンバラ・インスツルメンツ社のFLS1000とFS5分光器は、励起と発光のモノクロメーターにオーダー・ソーティング・フィルター・ホイールを標準装備しています。 これらのフィルターホイールはデフォルトで有効になっており、FLS1000およびFS5のFluoracle®ソフトウェアが、励起波長と発光波長の選択に基づいて使用する適切なフィルターを選択することで、完全に自動化されています。
このブログ記事が、蛍光スペクトルにおける2次アーチファクトの存在と、それがオーダーソートフィルターを使用することでどのように回避できるかを理解するのに役立ったことを願っています。
- Introduction to Fluorescence, D. M. Jameson, CRC Press (2014)
- Principles of Fluorescence Spectroscopy 3rd, J. R. Lakowicz, Springer (2006)
- Macías, M. C. Pinto, C. Gutiérrez-Merino, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan Solutions, Biochem Int. 15, 961-969 (1987)
- M. Hutnik, A. G. Szabo, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan: a Classic Example of Second Order Diffraction, Biochem Int. 16, 587-591 (1988)
Spectrometers for Preventing Second Order Diffraction
FS5とFLS1000分光器は、基礎研究と日常的な研究室でのアプリケーションの両方において、定常状態と時間分解のフォトルミネッセンス分光法の標準となるものです。 FLS1000とFS5の詳細については、[email protected] までお問い合わせください。
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