Targeting a moonlighting function of aldolase leads an apoptosis in cancer cell

Otto Warburgが、がん細胞はグルコースの取り込みと乳酸の産生が非常に高いことを発見して以来1、多くの研究が、がん細胞の大部分が解糖系のエネルギー産生に依存していることを明らかにしてきた2。

しかしながら、がんにおける解糖系酵素の非常に高い発現の生物学的意義は謎に包まれています。 解糖系の最初の酵素であるヘキソキナーゼは、後続の酵素に比べて発現量が少なく3、比活性や基質への親和性が比較的低い4,5。 そのため、その総活性によって解糖系のフラックスが制限される。

解糖系酵素は、その生理的役割が触媒機能に限定されないムーンライティング酵素6,7に属し、さまざまな細胞プロセスの調節因子として作用することができる。 私たちは、解糖系酵素であるアルドラーゼが抗がん剤治療の強力なターゲットとなる可能性があること、また、この酵素が媒介する複雑な細胞内相互作用の網目を乱すことが抗がん剤の作用に重要であることを示す証拠を提示する。

アルドラーゼは、解糖系の途中に位置し、フルクトース-1,6-二リン酸（FBP）をジヒドロキシアセトン-3-リン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に可逆的に切断することを触媒します。 その筋肉アイソフォーム（ALDOA）は、ほとんどすべての癌に最も多く存在するアルドラーゼのアイソフォームであり8、アクチンフィラメントを組織化し9,10、AMPK11,12とFBP213の活性に影響を与え、Wnt14,15とp53シグナルを制御する16。 また、ALDOAが細胞周期のS/G1期の進行に関与していることも明らかになっている17。 ALDOAは、がん細胞の生存と増殖に必要な多くの細胞事象に関与していることから、ALDOAの月並みな機能を阻害することで、抗がん剤治療の好ましいターゲットを提供できるのではないかという仮説を立てた。

その結果、正常細胞ではなくがん細胞において、ALDOAとアクチン細胞骨格との相互作用が阻害されると、活性酸素の大幅な増加、ATP合成の停止、カルシウムレベルの上昇などの一連の細胞内変化が起こり、その結果、カスパーゼが活性化され、細胞増殖が阻害されることがわかった。 これらの変化のメカニズムは、ALDOAの触媒機能とは無関係であることから、がん細胞におけるALDOAの過剰発現は、がん細胞の高い解糖系要求とは無関係であり、転移したがん細胞が上皮間葉転換期にアクチン細胞骨格の完全性を確保するための適応であると結論づけた。

UM0112176-新規ALDOA阻害剤-がん細胞の成長を有意に抑制

ALDOAとその結合パートナーとの相互作用を阻害するために、モントリオール大学の大規模な化合物ライブラリーのハイスループット・スクリーニングにより発見したALDOAの結合速度の遅い混合阻害剤（UM0112176；補足図S1a）を用いた。 UM0112176は、他の解糖系酵素を阻害することなく、ゆっくりとした結合様式でヒトALDOAの活性をIC50〜2〜5μMで阻害した（補足図S1b, c）。 UM0112176が生体内のALDOA活性を阻害する能力を、阻害剤の存在下で細胞を24時間インキュベートした後、フルクトース-1,6-ビスリン酸とトリオースリン酸の細胞レベルを測定することで検証した（Supplementary Fig. S1e）。 その結果、癌細胞（KLN205、マウス肺扁平上皮癌）と正常細胞（ラットアストロサイト初代培養細胞）の両方で、ALDOA基質の力価が有意に上昇し、ALDOA反応生成物が強く減少したことがわかった。

次に、UM0112176の用量反応曲線を求めたところ、10μMのUM0112176は、試験したすべてのがん細胞株の増殖を強く抑制した。 KLN205、hNSCLC（ヒト非小細胞肺がん細胞株）、BxPC3（ヒト膵臓腺がん）、AsPC1（ヒト膵臓腺がん腹水転移）である（Fig.1a）。 正常な細胞株（ラットのアストロサイト、マウスの心筋細胞-HL-1細胞株、ヒトの上皮細胞-ME16C）の増殖率は、10μMのUM0112176によってほとんど影響を受けなかった（Fig. 1a）。

細胞増殖速度の阻害が死亡率の上昇によるものなのか、増殖のブロックによるものなのかを区別するために、Ki67（細胞増殖のマーカー）と活性型カスパーゼ（カスパーゼ3、アポトーシスにおける最終エフェクター）の細胞発現をアッセイしました。 その結果、がん細胞では、10μMのUM0112176（24時間処理）により、Ki67関連の蛍光シグナルが強く減少し（Fig.1c）、活性型カスパーゼの存在が上昇した（Fig.1d）。 正常細胞では、48時間処理しても変化は見られなかった（Fig.1d）（Supplementary Fig.S2a）。

UM0112176の投与は、癌細胞ではアクチン細胞骨格を破壊し、活性酸素、ミトコンドリア膜電位、Ca2+、DSB、ATPレベルを変化させるが、正常細胞では変化しない

UM0112176の作用メカニズムを明らかにするために、この阻害剤が影響を与える可能性のある多くの細胞活動を調べた。 細胞骨格の形態、ATP濃度、活性酸素種（ROS）濃度、ミトコンドリア膜電位、二本鎖DNA切断（DSB）など、阻害剤の影響を受ける可能性のある細胞活動を調べた。 阻害剤の作用が最も顕著に現れたのは、阻害剤と24時間インキュベートした後、がん細胞ではF-アクチンのストレス線維が完全に消失したが、正常細胞では消失しなかったことである（図1e）。 興味深いことに、高分子アクチンの崩壊の開始は、in vitroでのALDOAの完全な阻害（約15分）よりもはるかに早かった（<5分）（補足図S3a）。

細胞骨格の破壊とともに、活性酸素やカルシウム濃度の上昇、ATP濃度やミトコンドリア膜電位の低下、さらには二本鎖DNAの切断の誘発が観察された（Fig.2a-e）。 重要なことは、UM0112176によってがん細胞に生じた変化は、（活性酸素の放出などによって）正常な細胞には伝わらなかったことである。

UM0112176で誘発された変化は解糖の阻害では説明できない

UM0112176で誘発された変化ががん細胞の解糖の阻害で再現できるかどうかをさらに検討するために、他の解糖酵素のエフェクターの影響を検証した。 ホスホグリセリン酸ムターゼ（PGAM）18を阻害するアリザリンレッドSと、6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトースビスホスファターゼ-2（PFK-2）19の作用を間接的に阻害する3-PO（(2E)-3-(3-ピリジニル)-1-(4-ピリジニル)-2-プロペン-1-オン）である。 PGAMを阻害すると、活性酸素が増加し（補足図S4a）、細胞質のカルシウムレベルには影響を及ぼさなかったが、PFK-2を阻害すると、活性酸素に変化はなく、細胞質のCa2+レベルが上昇した（補足図S4a、b）。 さらに、急速に増殖しているがん細胞（KLN205）でさえ、これらの阻害剤の存在下で、グルコースの取り込みを活性化するのではなく、グルタミンなどの他の栄養素を利用して、一定レベルの総ATPを維持することができた（Supplementary Fig.

UM0112176はALDOAとアクチンの相互作用を阻害する

アルドラーゼはアクチンやアクチン結合タンパク質と相互作用することが知られており8,9、細胞骨格のダイナミクスに影響を与えていると考えられる。 また、WASP依存性のアクチン重合を阻害し、細胞質分裂の障害を引き起こす20一方で、EMT転移で獲得したがん細胞の運動性など、アクチン依存性のプロセスを促進することもある21。 ALDOAのこのような複雑な役割は、UM0112176がALDOAに結合することで、観察されたF-アクチン細胞骨格の崩壊に関与しているのではないかという仮説を呼び起こす。

しかしながら、UM0112176は、βおよびγアイソフォームを含む細胞骨格アクチンのフィブリルフォームとALDOAとの結合を部分的に破壊したが（図3a）、筋肉（αアイソマー）アクチンポリマーの安定性には影響を及ぼさなかった（データは示さず）。 F-アクチン-アルドラーゼラフトでは、F-アクチンとアルドラーゼの接触は、主に1-8残基の領域と350-36522残基の領域の2つの場所で見られる。 抗原性プローブにより、アルドラーゼのタイトな結合部位は、α-アクチンマイクロフィラメントの保存されたC-末端領域にあることがわかった23。 ブラウン力学シミュレーションでは、アルドラーゼの結合に関与する類似のアクチン残基が見つかっている24。 1-8残基の違いがアクチンのアイソフォームを区別していることから25、アクチンのN-末端領域がアルドラーゼとの結合をアイソフォーム特異的に行うことになる。

興味深いことに、ALDOAの結合部位は、アクチン上のコフィリンの結合部位と重なっている27,28。コフィリンは、アクチン線維の解重合を促進することが知られているタンパク質であり29、その結合にはN末端とC末端のアクチン残基の重なりが関与している30。 ALDOAとコフィリンが大きな球状であることを考えると、アクチン結合部位が広範囲に重なっていることは、ALDOAとコフィリンがアクチン上の同じ結合部位をめぐって競合していることを意味する。 F-アクチン（β-γアイソフォーム）をALDOAとコフィリン（等モル濃度）の両方とインキュベートしたところ、F-アクチンの安定性に対するコフィリンの影響はほとんど見られず（図3b）、ALDOAがコフィリンの作用からF-アクチンを保護していることがわかった。 これは、コフィリンの解離定数が約10μM31であるのに対し、ALDOAはF-アクチン23とより強固に結合すると予想されることと一致する。 コフィリンによるアクチンの解重合に対するALDOAの保護作用は、UM0112176を添加すると消失した（図3b）。 ALDOAはin vitroでコフィリンと相互作用することができたが、UM0112176がこの相互作用を阻害する証拠は見つからなかった（補足図S2b）。 したがって、UM0112176によるF-actin細胞骨格の不安定化は、ALDOAがF-actin上のコフィリン結合部位と重なる結合部位から解離することにより、コフィリンのF-actinへの付着を可能にし、その解重合を媒介することで生じると考えられる。

UM0112176とALDOA（PDB: 1ZAJ）の相互作用を調べるために、ブラインド・モレキュラー・ドッキング解析を行った。 AutoDock32を用いて計算した結果、UM0112176のALDOAに対するポーズは、1つのメジャークラスターと2つのマイナークラスターに分かれた。 メジャークラスターには、約9.2kcal/moleの結合エネルギーを持つ17個のポーズが含まれ、マイナークラスターには、わずかに低い結合エネルギーを持つ3個のポーズが含まれていた。 目視では、トップのポーズがLys-293とCys-338の近傍に位置しており（Fig.3d）、これらのローターマーがUM0112176の-C≡Nおよび-Cl官能基とそれぞれ水素結合することを可能にしている。 Cys-72とCys-338が架橋33や酸化グルタチオンによって修飾されると、25Å離れた活性部位との長距離通信によって触媒活性34が阻害される。 酸化型グルタチオンによるALDOAの不活性化34で示されたように、UM0112176がALDOAの活性化に必要な触媒作用中の動的イベントを長距離にわたって阻害することは、その阻害動態と一致する。 興味深いことに、Lys-293はγ-アクチンとALDOAとの相互作用を促進することが示されており、K293A変異はその結合を無効にする26。 さらに、UM0112176の結合空洞を構成する残基は、ラルテグラビルのALDOA上で示された残基と重なっており、ラルテグラビル（100μM）による治療は、同所性肺癌モデルにおいて、マウスの生存率を対照群に比べて約2倍延長した26。

しかしながら、UM0112176が正常細胞において細胞骨格のアクチンに作用しないことを説明するものではない。

この結果は、UM0112176が正常細胞で細胞骨格のアクチンに作用しないことを説明するものではない。明らかに、正常細胞では、他のアクチン関連タンパク質がコフィリンによる解重合から細胞骨格を保護しなければならないが、がん細胞では、この保護が明らかに損なわれている。 そこで、私たちは、F-アクチン細胞骨格の解重合を促進し、アポトーシスを誘導することのできるがん特異的な因子を探した。 その結果、UM0112176を投与した際の顕著な細胞効果の1つとして、癌細胞のみで発生する非常に速い活性酸素生成の増加が認められた（Fig.2a）。

UM0112176投与後の活性酸素レベルの上昇は、主にNOX活性に起因する

NADPH依存性酸化酵素（NOX）は、細胞内活性酸素の重要な供給源であり、アクチン細胞骨格によって制御される36。 また、NOX1は、がん細胞の浸潤を促進するプロセスである上皮間葉転換に関与していることが明らかになっています37。 そこで我々は、UM0112176によるALDOAの重合アクチンからの脱離が、コフィリンによる細胞骨格の不安定化を可能にし、その後の脱重合が活性酸素の増加に関与しているのではないかと考えた。 興味深いことに、ほとんどのがん細胞では、NOXタンパク質（特にNOX1アイソフォーム）が正常細胞よりも高いレベルで発現している38（補足図S2c）。 そこで、がん細胞におけるNOX1の発現をサイレンシングしたり（図3h）、アポシニンを用いてNOX1の活性を阻害したりした39。

このアクチン依存性の活性酸素生成メカニズムは、UM0112176がALDOAのアクチンフィラメントからの置換を促進することで、コフィリンがアクチンフィラメントを解重合し、NOXを活性化することを示唆している。 活性化されたNOXによる活性酸素の生成は、スリングショットホモログ1の酸化還元活性化を可能にし、P-コフィリンを脱リン酸化させる40。 実際、UM0112176を添加すると、細胞内のP-cofilinレベルが低下した（補足図S5a）。 UM0112176の作用によりアクチンフィラメントから解離したALDOAは、脱リン酸化されたコフィリンがフィラメントに結合するための新たな結合部位を解放することにより、アクチンフィラメントのさらなる解重合を促進する。

意外なことに、アポシニンはUM0112176による細胞質カルシウムレベルの上昇を部分的にしか阻止せず、カスパーゼ3の活性化も防げなかった（図3i、j）。 アポシニンはUM0112176によるアクチンフィラメントの破壊を明らかに抑制したが、未処理の細胞と比較して細胞骨格がより束ねられているように見え、アポシニンとUM0112176で同時に処理した細胞は形態が変化した（Fig.3k）。 UM0112176またはアポサイニンとの併用による細胞骨格の摂動は、これらの癌細胞の適切な細胞骨格組織化のためのNOX1依存性の活性酸素生成と一致する。

UM0112176作用の細胞内メカニズムには、ミトKATPの開口部が関与している

アクチン細胞骨格とミトコンドリアの活性酸素産生およびアポトーシスを結びつける可能性のあるタンパク質は、ミトコンドリアのATP依存性カリウムチャネル（mitoKATP）であると考えられる。 細胞内のK+濃度とアポトーシスの関連性は多くの系で報告されており、mitoKATPが関与していることがわかっている41。 このチャネルは、アクチンの解重合に敏感で、チャネルの開口部を増加させ42,43、その結果、軽度のアンカップリングとミトコンドリアの活性酸素産生の増加を引き起こすと考えられている44。

我々は、ミトKATP44の開口部をブロックすることが知られている5HD（5-Hydroxydecanoate）で癌細胞を前処理したところ、5HDはUM0112176で誘導された活性酸素の増加をかなり減少させたことを確認した（図4a）。 5HDの前処理は、カスパーゼ3の活性化速度を有意に低下させたが（図4c）、UM0112176によるアクチン細胞骨格の破壊（図4b）とアポトーシスの誘導を阻止することはできなかった。

UM0112176によるカルシウム流入にはナトリウム-カルシウム交換体の逆モードが関与している

ALDOAへのUM0112176の結合は、正常細胞ではなくがん細胞のカルシウムレベルの有意な上昇にも関連していた（図2b）。 この増加は、KLN205では（<5分）、hNSCLC細胞では（～20分）よりも急速であった（図S4g）。 そこで、このカルシウムの起源を探ってみたところ、細胞外の貯蔵庫に由来することがわかった（図4d、e）。

続いて、NOX1とmitoKATPが細胞内の遊離Ca2+レベルの変化を相乗的に制御しているのではないかと考えた。 実際、NOX1を阻害すると、UM0112176によるCa2+の増加を部分的に防ぐことができた（図3i）。一方、mitoKATPの開口部を阻害すると、Ca2+の増加はほとんど見られなくなった（図4f, g）。

NOXの活性化はミトKATPの開口部を引き起こし、それが間接的にナトリウム-カルシウム交換体（NCXrev）の逆モードを刺激し、細胞内へのCa2+の流入を促進する可能性がある46。 そこで、UM0112176によるカルシウムの増加にNCXが関与している可能性を検証した。 実際、KB-R794346でNCXrevを阻害すると、カルシウムの流入量が減少した（図4h）。

アクチンの解重合がNCXrev活性を刺激することが示されており47、UM0112176添加時のCa2+流入を担う交換体がNCXであることをさらに裏付けている。

従って、NOXとミトコンドリア活性酸素48のクロストークが、活性酸素感受性MAPKカスケードの刺激を介して、膜輸送体、ナトリウム/水素交換体、ナトリウム/重炭酸ガス共輸送体を活性化し、NCXrev49を介してCa2+流入に至ると結論づけることができる。 さらに、細胞質のCa2+過剰負荷はNOX50を活性化し、ミトコンドリアのカルシウムユニポーターを介したミトコンドリアのCa2+負荷はミトコンドリアのROS産生を加速させる51。これにより、ROSとカルシウムのレベルが高く維持され、アポトーシスが誘導されるという正のフィードバックループが形成される。 NCXrevを阻害するとCa2+の流入が抑制されることから（図4h）、ミトコンドリアのKATPが開き、ミトROSが細胞質に放出される52ことがアポトーシスを引き起こす重要なイベントであると考えられている。

ALDOA阻害によるがん細胞特異的なATPレベルの低下は、HK2のミトコンドリアからの急速な解離を誘導する

UM0112176はすべての細胞株でATP合成を阻害したが、がん細胞ではATPの変化がより大きく、より急速であった（図2c）。 重要なことは、がん細胞ではなく正常細胞では、これらの変化は阻害剤を中止すると元に戻ったことである（補足図S4e）。 UM0112176を添加すると、KLN205細胞（約40%減）およびhNSCLC細胞（約20%減）では、ATPレベルの急激な低下（<5分）が誘導された（Supplementary Fig.

このUM0112176によるATP枯渇の二相性の動態から、がん細胞におけるATPレベルの急速な減少のメカニズムが疑問視された。 そこで我々は、ほとんどの癌細胞で発現が上昇しているヘキソキナーゼ2（HK2）の細胞内での局在を調べた。HK2は、完全な活性とミトコンドリアによる効率的なATP合成のためにミトコンドリアとの結合を必要とする4,5。 我々は、正常細胞ではなく癌細胞において、UM0112176処理後にHK2がミトコンドリアから急速に解離することを確認し（Fig.4i）、この変化の時間幅は活性酸素生成の時間幅と相関していた。

ALDOAの発現を抑制すると（補足図S5c）、UM0112176処理による観察結果が再現され（補足図S5d-f）、LewとTolan14,20が報告した結果と同様に、ATPレベルの低下は見られなかった。 このことから、ATPレベルの低下は、代謝活性の低下によるものではなく、UM0112176によって阻害されたALDOAとその結合パートナーとの月光性相互作用に起因するものであると考えられる。 Changらは、ALDOAの変異であるK293AがALDOAとγ-actinとの相互作用に影響を与えるが、解糖系フラックスの変化を伴わないことを指摘しており26、UM0112176がALDOAのmoonlighting相互作用を阻害しているとの解釈を支持している。

UM0112176の癌細胞に対する効果はFBPの蓄積では説明できない

観察された変化がALDOAの非代謝機能に関連しているのか、それとも酵素活性の阻害の結果、FBPが蓄積されたのかを検証するために、FBPがROSおよびATPレベルに及ぼす影響、ならびに細胞骨格構造に及ぼす影響を調べた。 FBP の膜貫通型の拡散効率は比較的低いものの、様々な細胞で活発かつ効果的に輸送されている可能性があります53,54。 このことは、アルドラーゼの活性部位とUM0112176の結合部位の間で長距離のコミュニケーションが行われていることを示しています。 同じFBP濃度でも、正常細胞にはわずかな影響しかなく（補足図S3c、d）、UM0112176による細胞処理で観察された傾向と同じであった。 アストロサイトに目立った変化が見られなかったことは、これらの細胞にNOX1がほとんど存在しないことと一致し（補足図S2c）、細胞骨格を適切に構成するためには、がん細胞におけるNOX1によるROS産生が重要であることを強調している。 UM0112176で処理してもアポトーシスを起こさない正常細胞に低レベルのNOX1が存在することは、UM0112176処理時にNOX1が癌細胞の選択性をもたらすことを否定することになるが、低グルコース培養液（5 mM）は脂肪細胞においてNOX4アイソフォームの脂質ラフトへのターゲティングを阻害し、NOX4アイソフォームを低活性膜画分に保持することが示されている55。

UM0112176はALDOAの核内局在を阻害する

予想外なことに、UM0112176を投与すると、がん細胞の核内からALDOAが消失した（補足図S5g）。 ALDOAの核内局在化は、細胞周期の進行と関連していることが示されているが17、ALDOAの核内輸送のメカニズムや細胞周期の制御における意義については、今後の研究が必要である

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