ウェスタン・ブロット（WB）は、タンパク質を検出・分析する一般的な方法です。 これは、電気泳動で分離されたタンパク質をゲルから膜に移し、特異的に可視化できるようにする技術（ブロッティングとも呼ばれる）に基づいて構築されています。 この方法は、1979年にH.Towbinらによって初めて報告され（Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979）、2年後にW.Neal Burnetteによってその名が付けられました（Burnette, 1981）。 Towbinらは、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへのタンパク質の電気泳動転写について述べており、元のゲルパターンが正確に得られました。 このセットアップは、標準的な7つのステップで構成されています（図1）。 ウェスタンブロッティングの標準的な手順。
サンプルが準備され、ゲルにロードされ、電気泳動中に負の電荷を帯びたタンパク質が正の電荷を帯びた陽極に向かって移動します。 さらにタンパク質を分析するために、ブロッティングと呼ばれる手順で、タンパク質を膜に転写します。 転写後、次のステップで膜とタンパク質の不要な相互作用を防ぐために、膜をブロックします。 目的のタンパク質を可視化するために、まずタンパク質特異的な一次抗体を用いてメンブレンをプローブし、続いて標識された二次抗体を用いて検出します。
ゲルの片方のウェルに別のマーカー溶液を加えることで、特定のタンパク質を確認するために使用される抗体の相互作用に加えて、タンパク質のサイズを推定することができます。 ゲル上での分離は、サイズだけではなく、分子の電荷、疎水性領域、変性の度合いなどによってもある程度左右されます。 実験のセットアップは、特定の調査に最適なように様々な方法で変更することができます。 結果を分析する際には、ブロット間のローディングおよび移動速度に関するレーン間のばらつきを考慮する必要があります。 さらに、サンプルの濃度範囲における生成シグナルの非線形関係も、結果を解釈する際に考慮すべき点です。 WB実験の結果は、抗体が特定のタンパク質に結合する能力、相互作用の強さ、対象タンパク質自体の濃度という3つの重要な要素に左右されます。 さらに、標的への結合の特異性と低い交差反応性も重要な特徴です。 グリコシル化などの翻訳後修飾や他のタンパク質との相互作用により、タンパク質のサイズが理論重量と異なる場合があるため、WBの結果は必ずしも容易に解釈できるものではない。
テクノロジー
サンプルの準備
WBの最初のステップは、分析するサンプル（組織、細胞、その他の溶液など）を準備することです。 通常、組織はブレンド、ホモジナイズ、または超音波処理によって分解される必要があります。 細胞を溶解してタンパク質を可溶化するためにバッファーを加え、変性や分解を防ぐために阻害剤を加えることもあります。 さらに、さまざまな種類のろ過や遠心分離を行ってサンプルを調製します。 サンプル間の比較を可能にするために、生成された抽出物の総タンパク質濃度を決定し、ゲル上に特定の量をロードできるようにすることが重要です。 通常，タンパク質濃度の測定には生化学的な測定法が用いられる。 抽出液を、グリセロールと色素（ブロモフェノールブルーなど）からなるローディングバッファーで希釈します。 グリセロールは抽出液の濃度を上げることでローディングを容易にするために、色素はサンプルを可視化するために添加される。 サンプルに熱を加えることでタンパク質の構造を破壊し，負の電荷が中和されないようにします（Mahmood & Yang, 2012）。
ゲル電気泳動
サンプルの準備ができたら、ゲル電気泳動によってタンパク質をサイズに応じて分離するために、抽出液を投入します。 ゲルに電界をかけると、電荷を帯びた分子が動き出します。 WBでは、タンパク質の分離にポリアクリルアミドゲルを使用しているため、ネイティブな状態で使用する場合は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）と呼ばれます。 変性条件の場合は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を添加するので、SDS-PAGEと呼ばれる。 SDSはタンパク質と結合し、本来の電荷とは関係なく、タンパク質の周りに負電荷のミセルを形成する。 変性条件はタンパク質の三次元構造を溶解し、タンパク質の電荷はそのサイズに相対するようになり、その結果、タンパク質はサイズによってのみ分離される。
ゲルは通常、密度の異なる2つの部分から構成されています。
ゲルは通常、密度の異なる2つのセクションから構成されています。(i) スタッキングゲル、(ii) セパレーティングゲル、図2。 この2つのセクションの違いは、pHとゲルの濃度にあります。 pHがやや酸性でアクリルアミドの濃度が低い場合、スタッキングゲルではタンパク質の分離が不十分であるが、分離ゲルに入る前にタンパク質が非常に明確なシャープバンドを形成することができる。 塩基性が高く、ゲル濃度が高い場合、分離ゲルでは、小さなタンパク質は大きなタンパク質よりもゲル内を速く移動するため、タンパク質がサイズによって区別されます。 プレキャストゲルは便利ですが、手でキャストすることも可能です。 ゲルを緩衝液に浸し、ゲルのウェルにタンパク質サンプルとマーカーをセットします。 ゲルに電圧をかけると，タンパク質は負の電荷を帯びてゲル内を移動し始めます。 電圧が高すぎると、ゲルが加熱され、バンドが変形する可能性があるので、適切な電圧を選択することが重要です
図2.
緩衝液に浸された典型的なゲル
メンブレンへのブロッティング
ゲル電気泳動の後、タンパク質は固体支持体であるメンブレンに移されます。 これがウェスタンブロットの第3ステップです。転写プロセスでは、電圧をかけてタンパク質をゲルからメンブレンに移します。 セットアップには，スポンジ，濾紙，ゲル，そしてゲルと正電極の間に置かれたメンブレンが含まれます（図3）。 これにより、負の電荷を帯びたタンパク質がゲルからメンブレンに確実に移動します。 膜には、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）、ナイロンの3種類があります。 ナイロン膜はいくつかの点で優れているが、バックグランドの結合率が高く、一部の色素では不可逆的に染色されるため、他の2つの選択肢に比べてこのタイプの膜は一般的ではない。 ニトロセルロース膜の主な利点は、検出方法にかかわらずバックグラウンドが低いことである。 ニトロセルロース膜は、平均孔径が比較的大きいため、低分子量のタンパク質の導入には使用しない方がよい。 また、乾燥すると膜がもろくなり、取り扱いが難しくなります。 より安定したPVDF膜は、再ラベル化が可能で、保管にも便利です。
図3.
図3：ゲル内のタンパク質をメンブレンにブロッティングし、ブロッキング、抗体の添加、洗浄を一定のスケジュールで行い、サンプルを可視化する。
ブロッティングにはウェットとセミドライという2つの方法があります。 ウェット法は、効率的な転写が必要な場合や、明瞭でシャープなバンドの高品質な転写が必要な場合に適しています。 また、大きなタンパク質の複合体を転写する場合にも適しています。 転写中、ゲル、メンブレン、濾紙は完全にバッファーに浸され、ゲルを乾燥させるリスクはありません。 セミドライブロッティングはより迅速で、必要なバッファーの量も少なくて済みます。
抗体プロービング
WBの第4ステップは抗体プロービングです。 目的のタンパク質に特異的に結合するのではなく、抗体が膜に非特異的に結合するのを防ぐために、膜上の残留部位を遮断する物質を使用します。 一般的に使用される物質は、乾燥脱脂乳、Tris Buffered Saline Tween（TBST）で希釈した5% Bovine Serum Albumin（BSA）、正常ヤギ血清、カゼイン、魚のゼラチンなどです（Mahmood & Yang, 2012）。 牛乳は入手しやすく安価であるが、すべての検出ラベルに適しているわけではない。 魚のゼラチンはバックグラウンドが低いが、一部のタンパク質を隠してしまう可能性があり、また比較的高価なブロッキングバッファーでもある。 BSAは安価ですが、血清には免疫グロブリンが含まれているため、交差反応が起こる可能性があります。 どのブロッキングバッファーもすべての異なる抗原抗体の相互作用に対して理想的ではないので、ブロッキング剤を慎重に選択することが重要である。 ブロッキングの手順は、適切なブロッキングバッファーでメンブレンを1時間以上インキュベートすることです。 長時間のインキュベーションを行う場合は、染色のアーチファクトやバックグラウンドのリスクを排除するために、+4℃でブロッキングを行う必要があります。 ブロッキングは、目的のタンパク質からのシグナルを減少させることなく、バックグラウンドを減少させるための微妙なバランスです。
その後、ブロッキングした膜を一次抗体とインキュベートします。 この抗体は、TBST、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、またはウォッシュバッファーで適切な濃度に希釈します。 抗体を再利用する場合は、BSAと一緒にインキュベートすることが好ましい。 膜を洗浄した後、一次抗体に結合する二次抗体と膜をインキュベートします。 二次抗体はレポーターで標識されています。 ポリクローナル抗体を二次抗体として使用する場合、若干のバックグラウンドが生じることがあります。 バックグラウンド染色の場合、二次抗体は、それが生成されたホストからの非免疫血清であらかじめブロックされていてもよい。
検出
WBの第5ステップでは、タンパク質-抗体-抗体の複合体を膜上で検出します。 二次抗体の標識には、図4に例示したように、酵素、蛍光色素、ビオチン化、金結合、放射性同位元素など、いくつかの種類があります。 酵素の中で最も一般的なのはHRPで，化学発光物質，化学蛍光物質，発色物質などと併用されます。 HRPは基質特異性が高く，バックグラウンドが少なく，安定しており，安価である。 化学発光では、HRPの酵素がルミノール過酸化物検出試薬のルミノールの酸化を触媒する。 この多段階の反応により発光する。 フェノールのような特定の化学物質は、発光を強めることができる。 直接的な方法としては、蛍光を用いる方法がある。蛍光体は励起されると発光するため、検出剤を必要としない。 定量的なウエスタン分析に適しており、異なる蛍光体が異なる波長の光を発するため、一度に複数のタンパク質を特異的に検出するマルチプレックスが可能である。 化学薬品や酵素を用いて、蛍光性の基質から活性のある蛍光体を生成させる方法を化学蛍光といいます。 信号強度をさらに高めるために、2段階のビオチン・ストレプトアビジンベースのシステムを使用することもできます。 また、金の蓄積によりタンパク質が暗赤色に染色される金結合法もあります。 放射性同位元素を使うこともできますが、特別な取り扱いが必要で、かなり高価です。
画像処理
画像処理はWBの6番目のステップで、フィルムを使ったアナログ的なものと、CCDカメラやスキャナーを使ったデジタル的なものとがあり、さまざまな種類の発光信号を取り込みます。 CCDイメージングデバイスは、高い検出感度と広いリニアレンジでの定量を可能にし、化学薬品の廃棄や暗室の必要もありません。
解析
WBの最後のステップは、結果を解析することです。 典型的な定性アプリケーションでは、目的のタンパク質の存在を確認し、目視により量を概算し、マーカーとの比較によりサイズを決定します。 特に、高感度の検出試薬や高度なイメージング技術などの改良と発展により、WBは定量的な分析のためのツールとして期待されています。 定量的なアプリケーションでは、相対的または絶対的な用語でタンパク質の量を定義する必要があります。 感度、信号の安定性、線形ダイナミックレンジ、正規化、S/N比などの要素を考慮する必要があります。 あるアッセイで確認できるタンパク質の最小値が検出限界（LOD）であり、正確な定量に使用できる信号強度の限界が定量限界（LOQ）である。 これらの条件に影響を与える要因は、抗体の品質と濃度、およびタンパク質の最小検出量を考慮した場合の露光時間である。 安定したシグナルシステムは、高感度、多重露光、および弱いバンドの検出の可能性に到達するための時間枠を広げます。 シグナルの強度がタンパク質の量に比例するような、均一で正確な定量を可能にする範囲は、リニアダイナミックレンジと呼ばれています。 過剰なタンパク質や高濃度の抗体によるシグナルの飽和を避けることが重要である。 LODが低く、弱いシグナルと強いシグナルの両方を定量することで、広い線形ダイナミックレンジが得られます。 対象となるタンパク質は、各ウェルにロードされたタンパク質の量や異なる濃度の変動を許容する内部基準で正規化する必要があります。 これは、ハウスキーピングやスパイクしたタンパク質で実現できます。 タンパク質を適切に定量するためには、シグナルとノイズの比率が重要です。
具体的な例
多くのタンパク質の理論重量は翻訳後の修飾により実際の重量とは異なりますが、ほとんどすべての市販抗体はWBを用いて検証されています。
Human Protein Atlasプロジェクトでは、プロジェクトで作成されたポリクローナル抗体の品質管理にWBが使用されています。
Human Protein Atlasプロジェクトでは、WBはプロジェクトで作成されたポリクローナル抗体の品質管理に使用されています。 現在、抗体のさらなる分析のためにsiRNA WBを使用しています。
一次抗体と二次抗体の希釈、最終的な検出ステップを含むWBプロトコル全体は、日常的に行われており、個々の抗体に対して特別な実験的最適化は行われていません。 まず、選択した細胞株および組織（RT-4、U-251MG、肝臓、扁桃の15?g、HSA-およびIgG-の25?g）の総タンパク溶解液を用意した。gのHSAおよびIgG枯渇血漿）とマーカー（PageRuler Plus Prestained Protein Ladder；Thermo Scientific社製）をプレキャストされた4-20% Criterion SDS-PAGE gradient gels（Bio-Rad Laboratories社製）にロードし、還元条件下で処理した後、Trans-Blot turbo（Bio-Rad Laboratories社製）を用いてPVDF膜（Bio-Rad Laboratories社製）にメーカーの推奨に従って転写した。 Criterion SDS-PAGEグラジエントゲルとマーカーを使用することで、10～250kDaのサイズのタンパク質を分析することができます。 膜をメタノールで活性化した後、ブロッキング（5％ドライミルク、0.5％Tween20、1×TBS、1mMトリス-HCl、0.15M NaCl）を行い、室温で1時間、一定の振とうを行います。 その後、膜を0,6?g/mlに希釈したHPA一次抗体と1時間インキュベートし、洗浄（1mMトリス-HCl、0.15M NaCl、0.05% Tween）、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（豚抗ウサギ1:4000、Dako）と45分間インキュベートする。 市販の抗体の場合は1:500の希釈液を使用し、二次抗体は豚の抗ウサギ（1:3000、Dako）またはヤギの抗マウス（1:3000、Dako）を使用する。 基質（Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate; Millipore）からのシグナルの検出には、CCDカメラ（Bio-Rad Laboratories）を使用しています。
HPAの典型的なウエスタンブロットを図5に示します。 HRPとCCDカメラを使った典型的なウエスタンブロットの結果。
参考文献とリンク
この方法を命名し、さらに詳しく説明した記事です。
Burnette WN., “Western blotting”: ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルから未修飾のニトロセルロースへのタンパク質の電気泳動転写と、抗体と放射性ヨウ素化タンパク質Aによる放射線検出&期; Anal Biochem&期; (1981)
PubMed: 6266278
ウエスタンブロッティングの手法、理論、トラブルシューティングについて書かれた論文です：
Mahmood T et al., ウェスタンブロット: technique, theory, とトラブルシューティング&期; N Am J Med Sci&期; (2012)
PubMed: 23050259 doi: 10.4103/1947-2714.100998
タンパク質の電気泳動による膜への移動を最初に記述した論文：
Towbin H et al, Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. (1992)
PubMed: 1422008
Western Blotting Principles and Methods – GE Healthcareが提供する無料のハンドブック：
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-se/service-and-support/handbooks
Western Blotting in the Human Atlas Protein project：
Western Blotting
Wikipedia – 関連リンク。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Western blot encyclopedia – ウェスタンブロットだけでなく、トラブルシューティング、プロトコル、抗体の選択など、役立つ情報が満載。
http://www.western-blot.us
Antibodypedia – 一般に公開されている抗体とその有用性を様々な用途で紹介したオープンアクセスのデータベースです。
http://www.antibodypedia.com
VIDEO: Step by step Western blotting, a tutorial made by Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu
。