Milchsäure wird in Form von L (+) oder D (-) Milchsäure oder als deren racemisches Gemisch produziert. Organismen, die die L (+)-Form oder D (-)-Form bilden, besitzen zwei Laktatdehydrogenasen (LDH), die sich in ihrer Stereospezifität unterscheiden. Einige Lactobacillen produzieren die L (+)-Form, die bei Akkumulation eine Racemase induziert, die sie in D (-)-Milchsäure umwandelt, bis ein Gleichgewicht erreicht ist.
Die L-Lactat-Dehydrogenase in L. casei wurde als allosterisches Enzym mit Fructose 1,6- Bisphosphat (FDP) gefunden. In einigen Fällen wirkt Mn2+ als Kofaktor. Die LDH in L. casei und Eukaryoten sowie in L. casei und Wirbeltieren zeigen 37% bzw. 76% Ähnlichkeit, aber die aktiven Stellen zeigen 70% bzw. 86% Ähnlichkeit, was zeigt, dass die wesentlichen Teile dieses Enzyms konserviert worden sind. Im Vergleich zu den Enzymen der Wirbeltiere fehlen bei L. casei 12-Aminosäurereste am N-Terminus, was unabhängig vom allosterischen Verhalten ein gemeinsames Merkmal bakterieller Enzyme ist. L. casei trägt auch 7 zusätzliche Aminosäurereste am C-Ende, aber es ist nicht bekannt, ob dies auch charakteristisch für bakterielle Enzyme ist, da keine vollständigen Sequenzen anderer bakterieller Enzyme verfügbar sind.
Trotz der Unterschiede in der Primärstruktur zeigt die kristallographische Analyse, dass die Gesamtstruktur der allosterischen Enzyme in L. casei und der nicht-allosterischen Enzyme in Wirbeltieren ähnlich sind. Daher sind wahrscheinlich die geringen Veränderungen in der Primärstruktur für das allosterische Verhalten verantwortlich. Das Fehlen der ersten 12 Aminosäuren am N-Terminus deutet auf eine mögliche Effektor-Bindungsstelle hin, die auch für die dissoziationshemmende Wirkung von Mn2+ bzw. (Mn2+ + FDP) auf das Enzym verantwortlich ist. Das tetramerische Enzym dissoziiert in Dimere, was auf die freie Lösungsmittelzugänglichkeit von Tyrosinresten hinweist, die sich möglicherweise nicht in der Kontaktregion der Untereinheit befinden. Tryptophanreste sind in der UV-Absorption und der Proteinfluoreszenz durch die Effektorbindung, aber es wurde festgestellt, dass die Proteinfluoreszenz in Dimethylsulfoniumbromid zerstört wird, und es gibt auch keinen Einfluss auf die FDP-Bindung. Daher kann es auf einen entfernten Tyrosinrest zurückzuführen sein. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Stoffwechselwege von L. casei durch die Art der verfügbaren Kohlenhydrate gesteuert werden, die die Menge an FDP und Triosephosphat-Intermediaten bestimmen. Diese kontrollieren die Aktivität von LDH und anderen Enzymen, um andere Metaboliten als Milchsäure zu produzieren. Auch über eine FDP-unabhängige Kontrolle der Lactatdehydrogenase wurde in L. bulgaricus berichtet. Wenn dieser Organismus in kontinuierlicher Kultur gezüchtet wurde, führt eine Verschiebung des pH-Wertes von sauer zu alkalisch dazu, dass er Zucker in einem Heterofermentationsmodus über den Phosphoketolase-Spaltweg katabolisiert. Dies deutet darauf hin, dass die Laktatdehydrogenasen in Milchsäurebakterien nicht nur durch allosterische Einflüsse, sondern auch durch die Genexpression kontrolliert werden.
Genetisch modifizierte Milchsäurebakterien für verbesserte L(+)-Milchsäurebakterien
Ein paar Versuche wurden unternommen, die L(+)-Milchsäureproduktion durch metabolisches Engineering in Laktobazillen zu verbessern, die sowohl L(+)- als auch D(-)-Milchsäure produzieren.
In Lactobacillus helveticus führte die Inaktivierung von ldhD (D-Laktatdehydrogenase-Gen) zu einer zweifachen Erhöhung der L(+)-Milchsäuremenge, wodurch die Gesamtmenge an Milchsäure auf das Niveau des Wildtyp-Stammes zurückgeführt wurde. Zwei stabile ldhD-negative Stämme von Lactobacillus helveticus wurden durch die Genersatzmethode konstruiert. Ein Stamm wurde durch eine interne Deletion der Promotorregion konstruiert, wodurch die Transkription des ldhD-Gens verhindert wurde. Das zweite Konstrukt wurde hergestellt, indem das ldhD-Gen durch ldhL ersetzt wurde, wodurch die Gendosierung verdoppelt wurde.
Die L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität war in den beiden modifizierten Stämmen um 53 % bzw. 93 % höher als im Wildtyp-Stamm. Die beiden D-Lactat-Dehydrogenase-negativen Stämme produzierten nur L(+)-Lactat in einer Menge, die der des Wildtyp-Stammes entsprach (Nikkila et al. 2000).
Das Gen, das für L(+)-Lactat-Dehydrogenase kodiert, wurde aus Lactobacillus plantarum isoliert und in Escherichia coli kloniert. Dieses Gen wurde sequenziert und verwendet, um Lactobacillus plantarum-Stämme zu konstruieren, die ldhL entweder überexprimieren oder nicht exprimieren. Ein Multikopie-Plasmid, das das ldhL-Gen trägt, wurde in Lactobacillus plantarum ohne Modifikation seiner Expressionssignale eingeführt. Dies erhöhte die L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität um das 13-fache, hatte aber kaum Auswirkungen auf die Produktion von L(+)-Lactat oder D(-)-Lactat. Eine stabile chromosomale Deletion im ldhL-Gen führte zum Fehlen der L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität und zur ausschließlichen Produktion des D-Isomers von Lactat (Ferain et al. 1994).
Wenn bei Lactococcus lactis die Kopienzahl des lac-Operons, in dem das ldhL-Gen enthalten ist, erhöht wurde, führte dies zu einem leichten Anstieg der Milchsäureproduktion (Davidson et al. 1995).
Das D-Laktatdehydrogenase-Gen (ldhD) von Lactobacillus johnsonii wurde isoliert und eine in vitro verkürzte Kopie dieses Gens wurde verwendet, um die genomische Kopie des Wildstammes zu inaktivieren. Dazu wurde eine 8-bp-Deletion innerhalb des klonierten ldhD-Gens erzeugt, um dessen Funktion zu inaktivieren. Das Plasmid, das das veränderte ldhD enthält, wurde durch konjugative Komobilisierung mit Lactococcus lactis auf Lactobacillus johnsonii übertragen. Crossover-Integrationen des Plasmids an der genomischen ldhD-Stelle wurden selektiert, und eine geeignete Auflösung der Strukturen führte zu Mutanten, denen die D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität vollständig fehlt. Die geringere verbleibende L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität leitete Pyruvat zu L-Lactat um, wobei die sekundären Endprodukte Acetaldehyd, Acetoin und Diacetyl nur geringfügig zunahmen (Lapierre et al. 1999).
E. coli ist ein fakultativer Anaerobier, der eine gemischte Fermentation durchführt Glucose-Dehydrogenase-Aktivität konnte ebenfalls nicht auf Glucose wachsen. Eine Alkohol-Dehydrogenase (adh), Phosphotransacetylase (pta)-Doppelmutante war jedoch in der Lage, anaerob auf Glukose zu wachsen, indem sie durch Laktatfermentation D-Laktat und eine kleine Menge Succinat produzierte. Eine zusätzliche Mutation im Phosphoenol-Pyruvat-Carboxylase-Gen führte dazu, dass die Mutante D-Laktat wie ein Homofermentierer produzierte, bei dem die Hauptprodukte Formiat, Acetat, D-Laktat, Succinat und Ethanol sind. Eine pta-Mutante, die nicht in der Lage ist, die für die Acetatbildung verantwortliche Phosphotransacetylase zu synthetisieren, war nicht in der Lage, auf Glucose zu wachsen. Eine adh-Mutante bildet keinen Alkohol in Milchsäurebakterien (Narayanan et al. 2004). In diese Mutante, der das D-Lactat-Dehydrogenase-Gen fehlte, wurde ein L-Lactat-Dehydrogenase-Gen eingeführt, was zur Produktion von L-Lactat-Dehydrogenase als Hauptfermentationsprodukt führte (Chang et al. 1999).
Rhizopus oryzae besitzt ethanolfermentative Enzyme, die es dem Pilz ermöglichen, für kurze Zeit in Abwesenheit von Sauerstoff zu wachsen. Es wurde eine Mutante isoliert, die unter O2-limitierenden Bedingungen nur 5 % der Alkoholdehydrogenase-Aktivität des Wildtyps exprimierte. Dadurch wurde Pyruvat zur Milchsäurebildung umgelenkt (Skory et al. 1998).
Rohstoffe
Im Laufe der Jahre haben Autoren eine große Anzahl von Kohlenhydraten und stickstoffhaltigen Materialien für die Milchsäureproduktion untersucht. Sie wurden auf der Grundlage von hohen Milchsäureausbeuten, optimaler Biomasseproduktion, vernachlässigbarer Nebenproduktbildung, schneller Fermentationsrate, weniger Vorbehandlung, einfacher Weiterverarbeitung, geringen Kosten, einfacher Verfügbarkeit usw. untersucht. Die Wahl des zu verwendenden Rohmaterials hängt von den untersuchten Mikroorganismen und auch vom gewünschten Produkt ab.
Kommerziell verwendet werden Saccharose (aus Sirupen, Säften und Melasse), Lactose (aus Molke), Maltose (durch spezifische enzymatische Stärkeumwandlungsprozesse hergestellt), Glucose (aus Stärkeumwandlungsprozessen, Mannitol etc. Melasse ist billig, liefert aber eine geringe Ausbeute an Milchsäure und erfordert aufwändige Reinigungsverfahren. Molke ist ebenfalls billig und leicht verfügbar, hat aber wie Melasse teure Reinigungsverfahren. Diese haben die Entwicklung von modernen Technologien wie Ultrafiltration und Elektrodialyse gefördert (Kulozik und Wilde, 1999). Hydrolysierte Kartoffelstärke, Mais, Stroh, Molke, Baumwollsamenschalen, Grapefruit, Sulfitablauge usw. wurden ebenfalls untersucht. Es wurden auch Studien zur Produktion von L(+)-Milchsäure durch R. oryzae unter Verwendung von Maisstärke und Maiskolben in einem Air-Lift-Bioreaktor und einem Faserbett-Bioreaktor durchgeführt.
Es werden auch Studien durchgeführt, um mikrobielle Prozesse für die Produktion von hochreiner L(+)-Milchsäure zu geringen Kosten aus Sago-Stärke zu entwickeln, die in Sarawak, Malaysia, Riau und Indonesien im Überfluss vorhanden ist. Milchsäure wurde auch durch gleichzeitige Sacharifizierung und Fermentation von vorbehandelter Alphafaser hergestellt.
Eine Reihe von stickstoffhaltigen Materialien wie Molkepermeat, Hefeextrakt, Malzsprossen, Malzkammnüsse, Grasextrakt, Peptone, Rindfleischextrakt, Kaseinhydrolysat, Mais-Sumpflauge, N-Z-Amin, Sojahydrolysat mit Zusatz von Vitaminen zur Ergänzung von Kohlenhydratquellen wurden untersucht, um schnelles und starkes Wachstum zu erzielen. Hefeextrakt scheint jedoch die effektivste Ergänzung zu sein. Elf verschiedene Stickstoffquellen wurden getestet. Verschiedene Mengen von B-Vitaminen wurden untersucht, um Hefeextrakt zu ersetzen (Hujanen und Linko, 1996). Diese werden auf einem minimalen Niveau gehalten, um den Verwertungsprozess zu vereinfachen. Zusätzliche Mineralien werden gelegentlich benötigt, wenn die Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen nicht in ausreichender Menge vorhanden sind.
Fermentationsprozesse
Die Milchsäuregärung ist dafür bekannt, dass das Endprodukt der Fermentation durch eine undissoziierte Form der Milchsäure gehemmt wird. Es wurden mehrere Studien durchgeführt, um dieses Problem zu überwinden. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung der extraktiven Milchsäuregärungstechnik eine Milchsäureausbeute von 0,99 g/l und eine Milchsäureproduktivität von 1,67 g/l/h im Vergleich zu einem konventionellen Batch-Reaktor ergab, der eine Ausbeute von 0,83 g/l und eine Milchsäureproduktivität von 0,31 g/l/h lieferte (Srivastava et al. 1992). Für die Lactatabtrennung wurde das Ionenaustauscherharz Amberlite IRA-400 verwendet. Da eine niedrigere Temperatur die Adsorption und eine höhere Temperatur die Milchsäureproduktion begünstigt, wurde eine Temperatur von 39 ºC als optimal für die Milchsäureproduktion durch extraktive Milchsäurefermentation angesehen. Die Anionenaustauschmethode wurde für die Milchsäuregewinnung aus Milchsäure-Glukoselösung in einem auf Ionenaustauschmembran basierenden extraktiven Fermentationssystem verwendet (Ziha und Kefung, 1995). Roychoudhury et al. 1995 haben die verschiedenen Prozesse der extraktiven Milchsäurefermentation beschrieben.
Es wurde gezeigt, dass Wasserstoffionen einen negativen Einfluss auf den Stoffwechsel von Lactococcus lactis-Zellen während des Elektrodialyse-Bioprozesses hatten, bei dem das Kulturfiltrat durch das Kathodenkompartiment zirkulierte (Nomura et al. 1998). Sie untersuchten die Stimulierung der Rate der L-Lactat-Fermentation durch periodische Elektrodialyse. Es wurde ein Elektrodialyse-Bioprozess untersucht, bei dem Laktat und Acetat gleichzeitig entfernt werden, wodurch ein niedriger Laktatgehalt in der Brühe aufrechterhalten wird, was die Hemmung der Endprodukte reduziert. Wasserstoffionen haben eine hemmende Wirkung auf den Stoffwechsel der Zellen; daher ermöglicht die Verwendung eines Standard-Elektrodialysators die Zirkulation des Kulturfiltrats durch das Dialysekompartiment, so dass die Kultur nicht mit der Kathode in Kontakt kommt. Dies ermöglichte einen vollständigen Verbrauch von Xylose in kürzerer Zeit.
Hauptsächlich zwei Reaktorsysteme führen zu hohen Ausbeuten und Produktivitäten der Milchsäure: – eine kontinuierliche Zell-Recycling-Fermentation (Abbildung 1) und eine gefütterte Batch-Fermentation (Abbildung 2). Es wird über eine hohe volumetrische Produktivität von 117 g/l/h unter Verwendung eines Membran-Zell-Recycling-Bioreaktors berichtet, der jedoch nicht zu einer hohen Produktkonzentration führt. Die Reaktoren werden in kontinuierlicher Weise mit kontinuierlicher Entlüftung der Zellen betrieben, um die Änderung der Fluidität zu verhindern, die auftritt, wenn die Zellkonzentration zu hoch wird. Um dieses Problem zu überwinden, wurden CSTR in Serie eingesetzt (Kulozik et al. 1992). Dies erhöhte die Produktivität und die Konzentration der Milchsäure. Die erhöhte Milchsäureausbeute ging auch auf Kosten der Biomassebildung in einer späteren Stufe. Eine hohe Reinheit des Milchsäureisomers L(+)-Milchsäure wurde auch durch eine erhöhte Population von Frischzellen erreicht. Die Leistung eines siebenstufigen Kaskadenreaktors mit Zellrecycling wurde untersucht. Membran-Zell-Recycling-Bioreaktoren (MCRB) in Serie wurden untersucht, wobei eine hohe Zelldichte mit einer hohen Milchsäureproduktivität von 5,7 g/l/h und einer Milchsäurekonzentration von 92 g/l erreicht wurde (Kwon et al. 2001). Die kontinuierliche Produktion von Ammoniumlactat in einem 3-stufigen Reaktor wurde untersucht (Borgardts et al. 1998). Verschiedene untersuchte Verweilzeiten zeigten eine höhere Laktatproduktivität und eine höhere Laktoseverwertung. Kontinuierliche Fermentationen unter Verwendung von Molkepermeaten wurden mit hohen Produktivitäten berichtet. Es wurden Experimente mit Zellrecycling untersucht. Eine volumetrische Produktivität von 76 kg/m3/h wurde mit einer ablaufenden Milchsäurekonzentration ermittelt. Die Milchsäureproduktion wurde mit immobilisierten Zellsystemen untersucht. Lactobacillus delbreuckii wurde in Calciumalginat-Perlen immobilisiert und in kontinuierlichen Durchfluss-Säulenreaktoren eingesetzt und erzielte eine Ausbeute von 0,97 g/g Milchsäure. Lactobacillus delbreuckii wurden in einem Hohlfaserreaktor immobilisiert. Es wurde eine Laktatproduktivität von 100 kg/m3/h beobachtet. Ein übermäßiges Wachstum der Organismen beeinträchtigte den Langzeitbetrieb des Reaktorsystems. Die Kinetik des Wachstums und der Milchsäureproduktion von Lactobacillus casei und Lactobacillus lactis wurden für lignozellulosehaltiges Hydrolysat aus zerkleinerten Maiskolben in der Zellretentions-Dauerkultur mit einem Ultrafiltrationsmodul, das die gesamte Biomasse zurückhält und die kontinuierliche Entfernung von Metaboliten ermöglicht, untersucht (Melzoch et al. 1996). Biofilme sind eine natürliche Form der Zellimmobilisierung. Es wurde gezeigt, dass die Milchsäureproduktion gesteigert wurde, wenn die Biofilm-Fermentation mit Chips aus Kunststoffverbundträgern PCS durchgeführt wurde, die 75 % (w/w) Polypropylen (PP) und 25 % (w/w) landwirtschaftliches Material enthielten (Demirci und Pometto, 1995). 24 PCS-Scheibenmischungen enthielten 50% (w/w) PP und 50% landwirtschaftliche Materialien für die L (+) Milchsäure-Biofilm-Fermentation in minimalen Medien ohne pH-Kontrolle. Jede PCS-Mischung wurde auf Biofilmentwicklung, langsame Freisetzung von Nährstoffen, Oberflächenkontaktwinkel, hydrophobe Kompatibilität mit Lactobacillus casei, Porosität und Milchsäureabsorption untersucht. Die PCS-Scheibe, die durchweg die höchste Leistung zeigte, enthielt 50 % (w/w) PP, 35 % (w/w) Sojabohnenschalen, 5 % (w/w) Hefeextrakt, 5 % (w/w) getrocknetes Rinderalbumin und Mineralsalze. Die Biofilmpopulation wird durch den Kontaktwinkel und die relative Hydrophobie der Träger beeinflusst. Die Verwendung von Kunststoff-Verbundträgern ergab eine hohe Biofilmpopulation, Zelldichte und Milchsäurekonzentration.
Die Lösungsmittelextraktion wurde für die Reinigung von Carbonsäure wie Milchsäure und Bernsteinsäure verwendet. Doch diese Lösungsmittel sind in-situ toxisch, da sie die Zellmembran aufreißen und der Metabolit austritt. Langkettige Alkohole wie 1-Octanol und 1-Decanol erwiesen sich als weniger toxisch als andere Verdünnungsmittel. Es hat sich auch gezeigt, dass kolloidale Flüssigapparate (CCA) nur einen geringen Unterschied in der Gleichgewichtsverteilung zum Lösungsmittel allein verursachen. Sie reduzieren die Toxizität der Lösungsmittel auf die Zellen.
Eine hohe Produktivität kann mit dem Membran-Recycling-Reaktor erreicht werden, aber er hat einen potenziellen Nachteil des Foulings. Bei hohen Zelldichten werden die Zellen unter Stress gesetzt und beginnen, das D-Isomer des Produkts zu produzieren. Hohe Zelldichten können durch die Verwendung von immobilisierten Zellen erreicht werden, aber ein kontrollierter pH-Wert ist eine Voraussetzung. Ein Rührkesselreaktor bietet eine effiziente Kontrolle des pH-Wertes, führt aber oft zur Abnutzung des Trägers. Ein adhäsiver Stamm von L. casei wurde auf zwei Festbettreaktoren beimpft, die kontinuierlich betrieben wurden. In Festbettreaktoren werden große pH-Gradienten erzeugt und ein wesentlicher Teil der Zellen erfährt keinen optimalen pH-Wert. Die Adsorption an einen Träger ermöglicht einen einfacheren und besseren Einschluss der Zellen. Die sich vermehrenden Zellen werden in das Medium freigesetzt, was dazu führt, dass die Zellen im Medium suspendiert sind (Bruno et al. 1999).
L(+)-Milchsäure wird kommerziell in Fermentationsprozessen mit Milchsäurebakterien oder Pilzen wie Rhizopus oryzae in submerser Kultur hergestellt. Rhizopus sp. kann L(+)-Milchsäure aus Stärke produzieren, aber die Ausbeute ist im Vergleich zu Milchsäurebakterien sehr gering. Unter Verwendung eines Air-Lift-Bioreaktors konnte unter optimalen Bedingungen L(+)-Milchsäure mit einer Ausbeute von 85 % produziert werden. Die Morphologie der Myzelien ist für die Fermentation nicht förderlich, da sie die Viskosität des Mediums erhöhen und sich um die Laufräder wickeln und Verstopfungen bei der Probenahme und in den Überlaufleitungen verursachen. Durch Regulierung der beimpften Sporenkonzentration in der Vorkultur wurden kleine Myzelpellets von R. oryzae erzeugt. Die Pellets haben jedoch das Problem des unzureichenden Stofftransfers. Mineralische Träger können verwendet werden, um eine watteartige Flockenmorphologie zu erhalten (Sun et al. 1999).
Die Perfusionskultivierung von Mikroorganismen ist eine effiziente Technik, um eine hohe Produktivität von extrazellulären Produkten zu erreichen. Der gerührte keramische Membranreaktor (SCMR) mit einem asymmetrischen Membranrohr erwies sich als effektiv, um eine hohe Permeabilität über lange Zeiträume aufrechtzuerhalten. Allerdings nahm die Produktionsrate während der wiederholten Batch-Fermentation allmählich ab. Nichtsdestotrotz ermöglichte die lang anhaltende, hohe Filtrationsleistung des SCMR die Auffüllung des Kulturüberstandes in kurzer Zeit (Ohashi et al. 1999).
Verschiedene Möglichkeiten der Milchsäure-/Laktatsalzabtrennung; Vor- und Nachteile
Das fermentierte Medium enthält entweder reine Milchsäure oder ihr Salz oder die Mischung aus beiden. Eine Klasse von vorteilhaften Aufbereitungsansätzen besteht darin, die Milchsäure aus der Fermentationsbrühe oder einem anderen Gemisch zu entfernen, während das lösliche Laktat in der Fermentationsbrühe zurückbleibt. Die Abtrennung kann in einigen Fällen innerhalb des Fermenters erfolgen oder sie kann an Lösungsmaterial durchgeführt werden, das aus dem Fermenter entfernt wird.
Eine Reihe von Ansätzen kann für die Abtrennung des Laktatsalzes aus dem fermentierten Medium verwendet werden, das sind die Extraktion durch Lösungsmittel, die Ionenaustauschabtrennung, die Abtrennung durch Adsorption, die Abtrennung durch Vakuumdestillation und die Membrantrennung (Eyal et al. 2001). Jedes dieser Verfahren weist einige Vor- und Nachteile auf, die auch bei den Fermentationsverfahren weiter oben in dieser Übersicht beschrieben wurden. Die Wahl des Trennverfahrens sollte sich an der effizienten und wirtschaftlichen Nutzung dieser Extraktionsmittel orientieren (Roychoudhury et al. 1995).
Nach Eyal et al. 2001 umfasst ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der Milchsäureprodukte aus dem Gemisch, das freie Milchsäure und das gelöste Laktatsalz enthält, die folgenden Schritte: – (a) Absenken des pH-Wertes der fermentierten Brühe (3,0 bis 4,2); (b) Verwendung einer hydrophilen Membran und der flüchtigen schwachen Aminbase (VAWB) zur Abtrennung der Milchsäure aus der fermentierten Brühe durch die hydrophile Membran zur VAWB; (c) Regeneration der Milchsäure aus den Salzen der schwachen Aminbase durch selektives Verdampfen der flüchtigen Aminbase. Dieser Prozess kann wiederholt werden, um eine effiziente Trennung von freier Milchsäure und ihrem Salz zu gewährleisten.
Milchsäurepolymere durch Polykondensation
Milchsäurepolymere bestehen hauptsächlich aus Lactyleinheiten, aus nur einer Stereoisoform oder aus Kombinationen von D- und L-Lactyleinheiten in verschiedenen Verhältnissen. Ein Nachteil der Polykondensation ist, dass ein Polymer mit niedriger Molmasse erhalten wird. Es gab Studien, um ein Polymer mit hoher Molmasse zu erhalten, indem das Gleichgewicht zwischen Milchsäure, Wasser und Polymilchsäure in einem organischen Lösungsmittel manipuliert wurde (Ajioka et al. 1995) oder ein multifunktionelles Verzweigungsmittel verwendet wurde, um sternförmige Polymere zu erhalten (Kim und Kim, 1999). In Gegenwart bifunktioneller Agenzien (Dipole und Disäuren) bilden sie telechelische Polymere, die mit Hilfe von Vernetzungsmitteln wie Diisocynat zu hochmolekularen Polymeren weiterverknüpft werden können (Hiltunen et al. 1997). Einen Überblick über die verschiedenen Polymere auf Milchsäurebasis, die durch Polykondensation und Polykondensation mit anschließender Kettenverlängerung hergestellt werden, gibt Tabelle 2.
Milchsäurepolymere durch Ringöffnungspolymerisation
Der Weg der Ringöffnungspolymerisation umfasst die Polykondensation von Milchsäure mit anschließender Depolymerisation zum dehydrierten zyklischen Dimmer, Lactid, das durch Ringöffnungspolymerisation zu Polymeren mit hoher Molmasse polymerisiert werden kann. Die Depolymerisation erfolgt konventionell durch Erhöhen der Polykondensationstemperatur und Senken des Drucks sowie Abdestillieren des entstandenen Lactids. Lösungspolymerisation, Massepolymerisation, Schmelzpolymerisation und Suspensionspolymerisation sind die verschiedenen Methoden der Ringöffnungspolymerisation (Niewenhuis, 1992). Der Polymerisationsmechanismus kann eine kationische, anionische, koordinative oder radikalische Polymerisation sein. Sie wird durch Verbindungen von Übergangsmetallen katalysiert: – Zinn, Aluminium, Blei, Zink, Wismut, Eisen und Yttrium (Nijenhuis et al. 1992). Auch andere ringförmige Monomere können durch ringöffnende Copolymerisation in das milchsäurebasierte Polymer eingebaut werden. Die meistverwendeten Comonomere sind Glykolid, Caprolacton, Valerolacton, Dioxypenon und Trimethylcarbonat. Der Vorteil der ringöffnenden Polymerisation ist, dass die Chemie der Reaktion genau gesteuert werden kann, wodurch die Eigenschaften des resultierenden Polymers kontrollierter variiert werden können.
Verschiedene Autoren haben die Synthese von Polymeren mit unterschiedlichem Molekulargewicht untersucht. Es wurde berichtet, dass Polymilchsäure mit hohem Molekulargewicht durch einstufige Polykondensation synthetisiert werden kann, wenn geeignete azeotrope Lösungsmittel verwendet werden. Die Katalysatorkonzentration, die Polymerisationszeit und die Temperatur haben einen großen Einfluss auf die Polymerausbeute, das Molekulargewicht und die optische Drehung.
Die Synthese von Polymilchsäure durch Polykondensation des Milchsäuremonomers ergab gewichtsmittlere Molekulargewichte von weniger als 1,6 x 104, während die Ringöffnungspolymerisation von Lactiden mittlere Molekulargewichte von 2 x 104 bis 6,8 x 105 ergab (Hyon et al. 1997). Der Monomerumsatz und die durchschnittlichen Molekulargewichte zeigten ein Maximum bei einer Katalysatorkonzentration von 0,05 % Zinnoktoat. Sie steigen linear mit der Polymerisationszeit bis zu einem Monomerumsatz von 80 % auf ein Maximum an, jedoch wird bei längeren Zeiten und höheren Polymerisationstemperaturen eine thermische Depolymerisation der resultierenden Polylactide beobachtet.
Die Synthese sternförmiger Copolymere ist abhängig vom Verhältnis von Monomer zu Initiator und Monomer zu Katalysator sowie vom Monomerumsatz (Dong et al. 2001). Bei der Polymerisation von Polylactid mit Methylglycolid unter Verwendung von Trimethylolpropan-Initiator hängt die Herstellung von drei- oder vierarmigen sternförmigen Polymeren vom Molverhältnis von Monomer zu Initiator und vom Monomerumsatz ab.
Es gibt eine interessante Studie zur Auswahl > 99:1 von Stereoisomeren der Milchsäure. Diels-Alder-Reaktionen des Acrylats von Ethyllactat mit Cyclopentadien verlaufen mit Diastereoface-Selektivitäten von bis zu 85:15 (nicht katalysiert) und 93:7 (TiCL4-gefördert). In Abhängigkeit von der Lewis-Säure werden Produkte mit inverser Konfiguration erhalten. Dies kann als Methode für großtechnische praktische Anwendungen der asymmetrischen Diels-Alder-Reaktion genutzt werden. Die Einflüsse des relativen Anteils von Lactid und Glycolid in der Mischung und der Katalysatorkonzentrationen haben sich als statistisch signifikant erwiesen. Der Einfluss von Zeit, Temperatur und Laurylalkohol auf das Molekulargewicht, die Zusammensetzung und die Kettenstruktur wurde ebenfalls von den Autoren untersucht (Dorta et al. 1993).
Anstrengungen bei der Herstellung von Milchsäure und milchsäurebasierten Polymeren
Technologische Fortschritte bei den wichtigsten Prozesskomponenten – Fermentation, primäre und sekundäre Reinigung, Polymerisation, chemische Umwandlung von Milchsäure und ihren Derivaten – würden eine kostengünstige, großvolumige und umweltfreundliche Produktion von Milchsäure ermöglichen. Jüngste Fortschritte in der membranbasierten Trennung und Reinigung würden eine Milchsäureproduktion ohne die Erzeugung von Salz- oder Gipsnebenprodukten ermöglichen. In kürzlich erteilten Patenten kann mit einem osmotoleranten Stamm von Milchsäurebakterien und einer Konfiguration aus Entsalzungselektrodialyse, wasserspaltender Elektrodialyse und Ionenaustauschreinigung ein konzentriertes Milchsäureprodukt hergestellt werden, das weniger als 0,1 % proteinhaltige Komponenten enthält, und zwar durch eine Kohlenhydratfermentation. Bei diesem Verfahren fällt als Nebenprodukt kein Salzgips, sondern nur eine geringe Menge Salz bei der Regeneration durch Ionenaustausch an. Es behauptet auch, einen geringen Energiebedarf zu haben.
Ecochem, eine Dupont-ConAgra-Partnerschaft, hat ein Rückgewinnungs- und Reinigungsverfahren entwickelt, das ein Nebenprodukt Ammoniumsalz erzeugt, das als Düngemittel verkauft werden kann (Anon, 1992). Diese Anlage hat eine Kapazität von 1000 Tonnen/Jahr. Für die Herstellung von Lactidpolymeren mit kontrollierter optischer Reinheit wurde ein kontinuierliches Verfahren entwickelt (Gruber, 1992). Das Verfahren verwendet eine Konfiguration aus mehrstufiger Verdampfung und anschließender Polymerisation zu einem niedermolekularen Präpolymer, das dann katalytisch zu Dilactid umgesetzt wird. Das gereinigte Dilactid wird in einem Destillationssystem mit teilweiser Kondensation und Rückführung zurückgewonnen. Das Dilactid kann zur Herstellung hochmolekularer Polymere und Copolymere verwendet werden. Ein neuartiges Verfahren zur Herstellung von zyklischen Estern, Dilactid und Glycolid wurde entwickelt. Bei diesem Verfahren wird ein Inertgas verwendet, um die zyklischen Ester aus der Reaktionsmasse wegzuspülen. Anschließend wird der verflüchtigte Ester durch Waschen mit einer geeigneten organischen Säure zurückgewonnen und gereinigt, und schließlich wird der zyklische Ester durch Fällung oder Kristallisation und Filtration der Feststoffe von der Flüssigkeit abgetrennt, wobei hochreines Lactid mit minimalen Verlusten durch Racemisierung entsteht. Die Rezyklierung und Wiederverwendung des Milchsäureanteils in den verschiedenen Prozessströmen wurde als machbar bezeichnet.
Die Technologie der Hydrogenolyse-Reaktion zur Herstellung von Alkohol aus organischen Säuren oder Estern hat sich in jüngster Zeit ebenfalls weiterentwickelt, neue Katalysatoren und Prozesse liefern hohe Selektivität und Raten und arbeiten bei moderaten Drücken. Diese Technologie wurde kommerzialisiert, um 1,4-Butandiol, Tetrahydrofuran und andere chemische Zwischenprodukte mit vier Kohlenstoffatomen aus Maleinsäureanhydrid herzustellen. In der Zukunft könnten solche Technologien mit kostengünstigen Prozessen zur Herstellung von Milchsäure integriert werden, um Propylenglykol und andere chemische Zwischenprodukte herzustellen.
Die auf L-Milchsäure basierenden Polymere können ein lineares Homopolymer mit der Molekulargröße >70 kDa produzieren. Das Hauptanwendungsgebiet von Milchsäurepolymeren sind medizinische Anwendungen, und eine Reihe von Unternehmen haben sich um die Herstellung von Polymere auf Milchsäurebasis und deren Produkte bemüht. Diese medizinischen Anwendungen umfassen seine Verwendung, wenn es verschiedene Eigenschaften in Bezug auf Zugfestigkeit, Viskosität, Reinheit usw. aufweist. L-Milchsäure-Polymer gibt es in drei verschiedenen Formen: als Feststoff, der zum Füllen von Lücken in Knochen verwendet werden kann, als Feststoff mit Zugfestigkeit zur Herstellung von Nahtmaterial und als Klebstoff, der hauptsächlich zum Verbinden von Membranen oder dünnen Häuten beim Menschen eingesetzt wird (Shikinami et al. 2002). Eine weitere wichtige Eigenschaft der Polymilchsäure ist ihre hohe Festigkeit gegenüber UV-Strahlung. Der biosorbierbare Klebstoff oder die klebrige Form der Milchsäure besteht aus einem Copolymer aus zwei oder mehreren biosorbierbaren Monomeren: – L-Milchsäure mit Dioxanon, mit Tri-Methylen-Carbonat und mit E-Caprolacton.Dow Chemicals und Cargill haben das größte Polylactid (PLA) produzierende Unternehmen mit einer Jahreskapazität von 140.000 Tonnen in Blair, USA (Anon, 1992). Das PLA wird durch ROP hergestellt und findet hauptsächlich in Fasern, Verpackungsmaterialien und als Lösungsmittel Anwendung. Es hat ein Joint Venture mit PURAC, Niederlande, für die Milchsäureproduktion in einer Maismüllerei. Es hat eine PLA-Geschäftsentwicklungskooperation mit Mitsubishi Polymers geschlossen. Apack, Deutschland, ist ein Lebensmittelverpackungsunternehmen, das die Polylactid-Technologie der ehemaligen Nestle Chemicals in Zusammenarbeit mit Fortum Oyj, Finnland, nutzt (Kivimaki, 2000). Galactic, Belgien stellt jährlich 1500 Tonnen Milchsäure aus Rübenzucker her. Brussels Biotech, eine Tochtergesellschaft von Galactic, arbeitet an den Forschungs- und Entwicklungsaspekten von Milchsäureprodukten (Bronnbann und Yoshida, 2000). Hycail, Niederlande, ein Joint Venture zwischen Dairy Farmers, USA und der niederländischen Staatsuniversität Groningen, plant den Bau einer Pilotanlage zur Milchsäureproduktion mit einer Kapazität von 400 Tonnen pro Jahr aus Molke und die Umwandlung der Milchsäure in PLA. Mitsui Chemicals, Japan, stellt PLA durch eine direkte Polykondensationsroute her. Shimadzu Corporation, Japan, produziert PLA durch ROP. Birmingham Polymers, USA und Phusi, Frankreich sind einige der anderen aktiven Hersteller von PLA (Ohrlander et al. 1999).
Die Forschung an milchsäurehaltigen Materialien hat mehrere Universitäten und Institute in Europa, Asien und den USA angezogen. Es gibt eine Reihe von kleintechnischen Produktionsanlagen für Polymilchsäure.
Wenn wir von reinen L(+)-Milchsäurepolymer-Industrien sprechen, haben wir nur wenige Namen wie Yipu, Dahuachem International, Sinochem Hebei Qinhuangdao Imp and Exp Corp, Zechem, und Qingdao FTZ united international Inc. in China; und PURAC, Macropore Biosurgery, ECOCHEM usw. in den USA. Die meisten von ihnen haben den halbnatürlichen Prozess für die L(+)-Milchsäurepolymer-Produktion übernommen. Der Prozess umfasst die Isolierung von L(+)-Milchsäure aus der durch Fermentation hergestellten Recemic-Mischung, indem ein enzymatischer Prozess für die L(+)-Milchsäure-Produktion aus der Recemic-Mischung angenommen wird, gefolgt von der Trennung durch teure Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Techniken (Oxoid, USA; und Cargill Co., USA).