A porosidade mesofílica é modulada pela presença de estomas funcionais

p> imagens MicroCT revelam variações no espaço aéreo foliar de trigo com ploidia. Imagens de amostras de folhas de Triticum urartu (2n), T. araraticum (4n) e T. aestivum cv Cougar (6n) em renderizações 3D de blocos de tecido (a-c), secções transversais (d-f), secções longitudinais (g-i), e secções paradérmicas (j-l), com tecido sólido em verde e espaço aéreo em amarelo. A porosidade mesofílica (%) (m-o) é traçada ao longo da profundidade da folha desde as superfícies adaxial a abaxial nas linhas diplóide (m), tetraplóide (n), e hexaplóide (o), como indicado. T. baoeticum-azul escuro; T. urartu-azul claro; T. dicoccoides-laranja escuro; T. araraticum-laranja claro; T. aestivum (Crusoe)-verde escuro; T. aestivum (Cougar)-verde médio-verde; T. aestivum (Shango)-verde claro. Para maior clareza, apenas valores médios de 6 amostras replicadas são apresentados em painéis m-o. As linhas em a-c indicam o plano da secção em g-i, respectivamente, também indicado por linhas verticais em j-l. As linhas horizontais em j-l indicam o plano de secção em d-f, respectivamente. Resolução da imagem = 2,75 µm. Barras de escala a-l = 200 µm

A troca de gás reflecte o espaço aéreo e o padrão estomacal

Usando a diversidade representada nestes parentes do trigo, procedemos à investigação dos efeitos das tendências observadas no tamanho/densidade estomacal e no espaço aéreo mesofila nas trocas gasosas, através de medições da condutância estomacal ao vapor de água (gs) e estimativas da condutância estomacal máxima (gsmax). Estes dados revelaram uma correlação positiva notável entre a porosidade da mesofila e gs (r2 = 0,915, P = 0,0007; Fig. 1l) com espécies diplóides mostrando gs elevados e folhas hexaplóides e de alta porosidade com gs baixos e baixa porosidade (Fig. 1k). Esta forte correlação de porosidade mesofílica e gs foi mantida quando foram considerados os dados individuais replicados de plantas pareadas para as várias linhas analisadas (correlação Pearson, r2 = 0,451, P = 0,0001; Suplemento Fig. 2). A diminuição da porosidade associada ao aumento do nível de ploidia também foi ligada a uma diminuição da área de superfície de mesofila exposta por volume de tecido, resultando numa forte correlação positiva de gs e este parâmetro (correlação de Pearson, r2 = 0,718, P = 0,016; Suplemento Fig. 3a) que também foi observada quando a área de superfície de mesofila exposta foi expressa numa base de área por folha (correlação de Pearson, r2 = 0,633, P = 0,0323; Suplemento Fig. 3b). A relação de gsmax (calculada usando medidas como mostrado na Fig. 3e Suplementar) e porosidade foi menos forte (correlação de Pearson, r2 = 0,487, P = 0,081; Suplementar Fig. 3c) do que a observada com gs (Fig. 1l). A análise do gsmax e da área do estômago revelou uma correlação inversa (correlação de Pearson, r2 = 0,613, P = 0,037) (Suplemento Fig. 3d) consistente com o trabalho anterior indicando um trade-off complexo entre o tamanho do estômago e a densidade em gs, com folhas exibindo densidades elevadas de estômagos mais pequenos transportando maiores gs por área do estômago do que as folhas com densidades baixas de estômagos maiores20,21. Globalmente, a nossa análise de gs, porosidade mesofílica e área de superfície exposta é consistente com a hipótese de que uma maior área de superfície mesofílica exposta e alocação do volume de tecido ao espaço aéreo facilita uma maior difusão gasosa de e para a mesofila.

A relação entre estomas e espaço aéreo mesofílico

As análises apresentadas acima são consistentes com, mas não provam, uma relação causal entre a diferenciação estomatológica e a formação do espaço aéreo mesofílico. Para testar esta hipótese, utilizámos uma série de linhas transgénicas de trigo com propriedades estomatais alteradas. Evidências significativas mostram que a padrões estomatais é controlada através de uma série de sinais peptídeos móveis, Factores de Padrões Epidérmicos (EPFs)22,23,24, que fornecem ferramentas eficazes para alterar a densidade estomatal e, assim, investigar o resultado sobre a diferenciação mesofílica7. A sobreexpressão de EPF1 ou do seu parente próximo EPF2 em Arabidopsis demonstrou levar a uma diminuição da densidade estomatal25 e a sobreexpressão de um gene cognato no trigo (TaEPF1) demonstrou recentemente levar a um fenótipo semelhante26.

A imagem focal das linhas TaEPF1-OE revelou que algumas células nos ficheiros epidérmicos que formam o estômago parecem ter sofrido os eventos iniciais da formação do estômago, mas não passaram pelo processo de divisão final para gerar o complexo estomatológico e os poros (Fig. 3a). As células mesofílicas que subentenderam directamente estes estômagos-progenadores anormais não mostraram sinais de separação celular, enquanto que os estomas maduros em cavidades subestomatais claras (Fig. 3b, c). A contagem da presença/ausência de cavidades subestomatais confirmou uma total ausência de cavidades do espaço aéreo abaixo das células de linhagem estomatais abortadas nas linhas de trigo TaEPF1-OE, enquanto todos os estomas diferenciados foram subtendidos por cavidades (Fig. 3h). A imagem microCT das folhas de TaEPF1-OE também revelou uma falta de cavidades subestomatais em comparação com a WT (Fig. 3d, e) e uma mesofila mais densa (Fig. 3f, g). A quantificação da estrutura das folhas revelou que as folhas de TaEPF1-OE tinham de facto uma porosidade inferior à do WT (Fig. 3i). As medições de troca de gás revelaram uma diminuição significativa em gs nas linhas TaEPF1-OE em comparação com as folhas não transgénicas de controlo (Fig. 3j).

EPF prende o desenvolvimento da cavidade substomatal e diminui a porosidade mesofílica no trigo. a Confocal overview of a TaEPF1 OE leaf showing epidermal layer (purple), subtending mesophyll cells (green), a stomate (St) consisting of guard cells and associated subsidiary cells and, in the same file, an arrested stomatal precursor (Ap). Barra de escala = 60 µm. b, c Imagens de maior resolução de (b) o estômago e (c) célula precursora estomacal presa mostrada em a. Barra de escala = 40 µm. d-g microCT imagens de um tipo selvagem (WT) (d, f) e uma folha de TaEPF1 OE (e, g) num plano paradérmico dentro da mesofila subtendendo directamente a epiderme (d, e) ou mais profundamente na folha (f, g), com tecido sólido em verde e espaço aéreo em amarelo. Os espaços aéreos maiores em d, e indicam cavidades sub-estomatais. Note menos cavidades substomatais na folha de TaEPF1 OE. Barras de escala = 100 µm. h-j No trigo WT e duas linhas independentes de trigo transgénico sobreexpressoras de TaEPF1 (como indicado), (h) a densidade de estomas (n = 87), cavidades subestomatais (n = 87) e células precursoras de estomas presas (n = 52 de 5 folhas independentes); (i) porosidade mesofílica medida a partir da análise microCT (ANOVA, F(2,12) = 4.977, p = 0,027); e (j) condutância estomatológica, gs, são mostradas (ANOVA, F(2,12) = 46,86, p < 0,0001). Para i e j foi realizada uma análise post-thoc Tukey (n = 5). As linhas que partilham a mesma letra são indistinguíveis uma da outra no p < 0,05 limite de confiança. Os dados (h-j) são mostrados como gráficos de caixa (percentil 25º-75º, linha horizontal = mediana) com bigodes indicando valores máximos e mínimos

Para investigar melhor a potencial ligação da separação de células subepidérmicas com os eventos de diferenciação estomatológica, explorámos o facto de que o eixo longitudinal de uma folha de relva proporciona um gradiente de desenvolvimento de diferenciação tecidual, com células na base proximal a serem divididas para gerar células que entram numa série de vias de desenvolvimento, incluindo a formação de estomas, em regiões mais distais da ponta23. A análise da linha de controlo (o progenitor não transformado das plantas transgénicas TaEPF1-OE) não revelou qualquer gradiente na densidade estomacal nas regiões observadas na ponta, no meio ou na base da folha madura 5 (Suplemento Fig. 4a). Contudo, uma análise semelhante de folhas comparáveis das linhas de TaEPF1-OE transgénicas indicou uma diminuição da densidade estomatológica na base da folha 5 (Suplemento Fig. 4b) que se reflectiu numa diminuição da porosidade nesta região, tal como revelado pela análise CT (Suplemento Fig. 4c). Para melhor identificar regiões na base das folhas de trigo em que a diferenciação estomatológica estava apenas a começar, utilizámos a microscopia confocal para analisar as folhas 3 das plântulas de trigo numa fase relativamente precoce de desenvolvimento. Isto revelou que as regiões mais distais da ponta destas folhas se distinguiam por terem complexos estomatais maduros (Fig. 4a) subtendidos por espaços aéreos relativamente grandes (Fig. 4b, c). Em contraste, nas regiões de base mais proximais onde as células epidérmicas submetidas a padrões de divisão característicos da diferenciação estomatológica eram claramente visíveis (Fig. 4d), embora espaços aéreos ocasionais fossem visíveis nos interstícios de algumas células subepidérmicas adjacentes (Fig. 4e), ambas eram muito mais pequenas do que as observadas no tecido mais proximal (Fig. 4b, c). 4b) e não apresentavam qualquer padrão evidente ligado aos estomas de diferenciação sobrepostos (Fig. 4f).

progressão do desenvolvimento da diferenciação estomatológica e formação do espaço aéreo mesofila. a-f Imagens confocais de folhas 3 de plântulas de trigo (6n) colhidas na região da ponta distal (a-c) ou na base proximal (d-f). As imagens são da epiderme (a, d) ou da mesofila subtil (b, e), com paredes celulares de cor falsa e sobrepostas em (c, f). Um estômago maduro é visível em a, com dois estômagos imaturos em d. Um grande espaço de ar subtrai o estômago em a (indicado por asteriscos em b, c). Pequenos espaços aéreos (asteriscos) são visíveis em e, f nas junções celulares. g-l Imagens confocais de folhas de Arabidopsis na maturidade (g-i) ou no desenvolvimento precoce (j-l). As imagens são da epiderme (g, j) ou mesofila subtil (h, k) com parede celular de cor falsa e sobreposta em i, l. Um estômago maduro é visível no centro (g), com numerosos estômagos em várias fases de desenvolvimento em j. Um espaço aéreo relativamente grande (asteriscos) é visível abaixo do estômago central (h), enquanto que alguns espaços aéreos muito pequenos (asteriscos) são distribuídos dentro da mesofila imatura (k, l) nas junções celulares. Barra de escala c, f = 20 µm; i, l = 25 µm

Estes resultados apoiam as hipóteses de que a separação celular ocorre na mesofila subepidérmica como parte de um programa endógeno de desenvolvimento, mas que o tamanho e distribuição dos espaços aéreos eventualmente formados é promovido pela presença de estomas adjacentes e diferenciados. Os dados sugerem que existe uma ligação causal entre a densidade estomatológica e a porosidade geral da mesofila, e que as trocas gasosas e a porosidade da mesofila estão funcionalmente ligadas.

Para investigar potenciais factores fisiológicos para estas alterações, comparámos a taxa de assimilação fotossintética, a condutância da mesofila com o CO2 (gm), e a eficiência instantânea do uso da água (iWUE) das linhas de trigo com diferentes níveis de ploidia. Isto não revelou nenhuma tendência evidente ligando a taxa de assimilação (Fig. 5a suplementar) ou gm (Fig. 5c suplementar) com o nível ploidy, e nenhuma correlação óbvia da taxa de assimilação com a porosidade da mesofila (Fig. 5e suplementar). Em contraste, as linhas de trigo 6n tinham um iWUE significativamente mais elevado do que as linhas 2n e 4n (Suplemento Fig. 5b; ANOVA com Tukey posthoc, P = 0,0005 e P = 0,013, respectivamente). Isto foi espelhado por uma diminuição da superfície de mesofila exposta por volume calculada a partir das nossas análises CT (Suplemento Fig. 5d), com 6n linhas com valores significativamente mais baixos em comparação com as 2n linhas (ANOVA com Tukey póstumo, P = 0,0001). Curiosamente, as medições do volume de células mesofílicas através de microscopia de luz confocal revelaram um claro aumento com o nível de ploidia (Suplemento Fig. 5f). Tendo em conta a relação fixa da área de superfície com o volume para formas semelhantes, estes dados encaixam com a hipótese de que durante a selecção do trigo moderno houve um aumento do tamanho das células de mesofila, com concomitante diminuição da área de superfície exposta e diminuição da porosidade da mesofila, bem como alteração dos parâmetros estomatais de aumento do tamanho e diminuição da densidade. Como estes estão mecanisticamente ligados e integrados ao nível de toda a folha para melhorar a eficiência da utilização da água aguarda mais investigação.

Para investigar a potencial ligação causal entre a diferenciação estomatológica e a formação do espaço aéreo mesofila, convertemos as nossas análises em eudicots, sujeitando uma série de linhas transgénicas de Arabidopsis previamente demonstradas como tendo alterado a densidade estomatológica27 a uma análise combinada de microCT e de troca de gases. Concentrámo-nos nas linhas em que a sobreexpressão de EPF2 leva a folhas com uma densidade estomatológica significativamente mais baixa (EPF2OE), e onde a perda de EPF2 e do seu homólogo (EPF1) (epf1epf2 mutante) gera folhas com uma densidade estomatológica significativamente mais alta25. Imagens microCT exemplares para cada linha são mostradas na Fig. 5a, b, d com imagens SEM de estomas mostradas na Fig. 5e, f, h e confirmação do fenótipo da densidade estomatal esperada mostrada na Fig. 5i.

porosidade da mesofila é modulada pela troca gasosa através de poros estomatais. a-d 3D microCT renderizações de blocos de tecido (resolução = 2.75 μm; amostras = 1,1 mm2) e (e-h) imagens SEM exemplares de estomas de folhas de Arabidopsis EPF2-OE, Col-0, focl1-1 e linhas epf1epf2 (barras de escala = 10 μm). São mostrados os meios e desvio padrão para (i) densidade estomatológica (ANOVA, F(3,11) = 19,17, p < 0,0001), (j) porosidade mesofílica da paliçada (ANOVA, F(3,20) = 6,329, p = 0.0034) e (k) condutância estomatológica, gs (ANOVA, F(3,20) = 26,22, p < 0,0001) para as linhas arábidas em a-d, com n = 6, excepto para a densidade estomatológica onde n = 4 (focl-1), n = 2 (EPF2-OE) e n = 3 (epf1epf2). Os dados Col-0 são como na ref. 13. As linhas indicadas com a mesma letra não se distinguem entre si na p < 0,05 limite de confiança (posthoc Tukey). l Palisade mesophyll porosity is plotted against stomatal conductance, gs, for individual leaf samples from the four Arabidopsis lines, as indicated. Os resultados da regressão linear são apresentados

Folhas de Eudicot (como se encontra na Arabidopsis) são distintas das folhas típicas de monocotiledônea (exemplificadas pelo trigo neste trabalho), na medida em que mostram caracteristicamente duas regiões mesofílicas, a paliçada adaxial e as camadas esponjosas abaxiais, que se distinguem por terem diferenças de desenvolvimento na forma celular e no espaço aéreo (porosidade)13. Ao seleccionar volumes de interesse dentro das folhas das linhas de Arabidopsis, obtivemos dados distintos de porosidade para as respectivas paliçadas e camadas esponjosas. Embora a comparação dos valores médios da porosidade mesofila global sugerissem diferenças limitadas entre as linhas, isto reflectia principalmente a semelhança nos valores da porosidade mesofila esponjosa (Fig. 6 suplementar). Em contraste, a porosidade da mesofila da paliçada (que está mais fortemente associada à eficiência fotossintética do que a porosidade da mesofila esponjosa13) mostrou maiores diferenças entre as linhas, com a paliçada epf1epf2 a ter a maior porosidade (Fig. 4j), e a maior densidade estomacal (Fig. 4i). Estes dados sugerem uma situação mais complicada na folha eudicot Arabidopsis em comparação com a folha de trigo monocotiledônea. Manipulações que alteram a densidade estomatológica na Arabidopsis podem levar a alterações evidentes na porosidade da mesofila, mas o resultado é ditado pela identidade da mesofila (paliçada ou esponjosa). As observações enquadram-se numa interpretação em que um padrão de desenvolvimento de diferenciação da mesofila é estabelecido muito cedo no desenvolvimento da folha (definindo paliçadas e camadas esponjosas em eudicópteros)28,29 com a identidade da mesofila estabelecendo a escala de modulação da porosidade por factores que ocorrem mais tarde no desenvolvimento, tais como sinais associados a padrões estomatais. Além disso, tal como com o trigo, uma análise das fases iniciais da diferenciação estomatológica apoiou a ideia de que o grau e extensão da formação do espaço aéreo mesofila era modulado pela presença de estomas maduros e diferenciados. Assim, durante a fase de crescimento das folhas em que as divisões das células epidérmicas conducentes aos estomas estavam a ocorrer (Fig. 4j), os espaços aéreos eram visíveis nos interstícios de algumas células subepidérmicas (Fig. 4k), mas não havia nenhuma semelhança evidente no padrão destes espaços aéreos e nos estomas diferenciadores sobrepostos (Fig. 4l). Na fase de desenvolvimento em que os estomas totalmente diferenciados eram visíveis (Fig. 4g), havia numerosos e grandes espaços aéreos ao longo da mesofila subepidérmica (Fig. 4h), com estomas sempre subtendidos por um espaço aéreo (Fig. 4k), mas não havia similaridade explícita no padrão destes espaços aéreos e dos estomas diferenciadores sobrepostos (Fig. 4l). 4i).

Condutância estomatológica e modulação do espaço aéreo mesofila

Os nossos dados, tanto do trigo como do Arabidopsis, apoiam a hipótese de que a presença de estomas modula o grau de porosidade da mesofila. Contudo, a nossa observação de que a porosidade da paliçada na linha EPF2OE em Arabidopsis não é diferente do Col-0 (Fig. 5j), apesar de uma diminuição maciça da densidade estomacal (Fig. 5i), sugere que não se trata simplesmente de um processo directo em que a diferenciação das células de guarda leva a um aumento/diminuição proporcional na separação das células mesofílicas (como tem sido sugerido7). Uma hipótese alternativa (embora não exclusiva) é que o funcionamento real dos estomas para permitir a troca de gás é um importante factor de ligação entre a densidade estomatológica e a porosidade da mesofila. De facto, os nossos dados sobre o trigo mostram uma forte correlação positiva entre a porosidade da mesofila e gs (Figs. 1l, 3i, j). Testamos esta hipótese em Arabidopsis, explorando um mutante estomatal recentemente caracterizado, focl1-1, no qual as etapas finais da formação da saliência cuticular da guarda são perturbadas30. Isto resulta na maioria dos poros que formam os estômagos, que estão inicialmente completamente cobertos por uma camada lipídica/de partículas. À medida que amadurecem, a cutícula através de aproximadamente 10% dos estomas torna-se rasgada, levando inevitavelmente a buracos que devem permitir um grau limitado de troca de gás para dentro e para fora da folha através das cavidades subestomáticas visíveis formadas. Um focl1-1 estômago parcialmente coberto é mostrado na Fig. 5g e pode ser comparado com os poros estomatais abertos observados nas folhas de Col-0, EPF2OE, e epf1epf2 (Fig. 5e-h). A presença de poros estomatais parcialmente cobertos fornece uma ferramenta útil para investigar até que ponto a porosidade mesofílica está ligada à troca gasosa. Uma análise combinada de microCT e troca de gás das quatro linhas de Arabidopsis revelou uma correlação positiva altamente significativa de gs e porosidade paliçada (correlação de Pearson, r2 = 0,471, P = 0,0002; Fig. 5l), com o agrupamento de dados focl-1 mutante abaixo dos do controlo Col-0 e no mesmo nível das amostras EPF2OE. Quando a taxa de assimilação das folhas individuais das plantas mutantes é considerada em relação à porosidade da paliçada, embora exista uma fraca correlação (Suplemento Fig. 7a; correlação Pearson, r2 = 0,289, P = 0,007), a relação da porosidade com a eficiência do uso da água é muito mais forte (Suplemento Fig. 7b; correlação Pearson, r2 = 0,526, P = 0.0001), consistente com a hipótese de que a restrição da perda de água pode ser o principal condutor das alterações na estrutura das folhas observadas.

Overall, estas observações apoiam a ideia de que, para além de um potencial sinal directo de células de guarda diferenciadas, o funcionamento real dos estomas para permitir a troca de gás desempenha um importante papel funcional na promoção da separação celular e eventos de crescimento que, em última análise, controlam a porosidade mesofílica.