Desde a descoberta de Otto Warburg de que as células cancerosas apresentam uma taxa extremamente elevada de absorção de glicose e produção de lactato1, uma série de estudos demonstrou que a maioria das células cancerosas depende da produção de energia glicolítica2. Isto tem estimulado laboratórios em todo o mundo a procurar inibidores da glicólise como potenciais drogas anticancerígenas.
No entanto, o significado biológico da expressão muito elevada de enzimas glicolíticas em cancros é enigmático. A primeira enzima da glicólise-hexoquinase, é expressa a um nível mais baixo em comparação com enzimas sucessivas3, e tem uma actividade específica relativamente baixa e afinidade com substratos4,5. Assim, a sua actividade total limita o fluxo através da glicólise. Assim, a superabundância de enzimas glicolíticas nas células cancerosas não pode promover um catabolismo glicólico mais rápido, mas deve ser associada a outros processos não-catalíticos.
As enzimas glicolíticas pertencem às enzimas de luz da lua6,7 cujo papel fisiológico não se limita à função catalítica e que podem actuar como reguladores de uma variedade de processos celulares. Apresentamos evidências de que uma enzima glicolítica, aldolase, pode ser um alvo poderoso na terapia anti-cancerígena e que a perturbação de uma teia complexa de interacções intracelulares mediadas pela enzima é fundamental para a sua acção anti-cancerígena.
Aldolase é posicionada a meio da via glicolítica e catalisa a clivagem reversível do fructose-1,6-bisfosfato (FBP) ao diidroxiacetona-3-fosfato e ao gliceraldeído-3-fosfato. A sua isoforma muscular (ALDOA), que é a isoforma aldolase mais abundante em quase todos os cancros8, pode organizar filamentos de actina9,10, afectar as actividades de AMPK11,12 e FBP213, e regular a sinalização Wnt14,15 e p5316. Foi também demonstrado que ALDOA está envolvido na progressão da fase S/G1 do ciclo celular17. Uma vez que ALDOA participa em muitos eventos celulares necessários para a sobrevivência e proliferação das células cancerosas, colocámos a hipótese de que a perturbação das funções de iluminação da lua de ALDOA poderia fornecer um alvo preferível para a terapia anti-cancerígena.
Os nossos resultados revelam que em células cancerosas mas não em células normais, a perturbação da interacção ALDOA com o citoesqueleto actínico provoca uma sequência de alterações intracelulares, incluindo uma elevação significativa da produção de ROS, cessação da síntese de ATP e aumento dos níveis de cálcio, o que resulta na activação da caspase e bloqueio da proliferação celular. Uma vez que o mecanismo destas alterações é independente da função catalítica da ALDOA, concluímos que a sobreexpressão da ALDOA nas células cancerosas não está relacionada com as suas elevadas necessidades glicolíticas, mas representa uma adaptação através da qual as células cancerosas metastáticas asseguram a integridade do seu citoesqueleto actínico enquanto passam pela transição epitelial-mesquímica. Assim, o mecanismo de acção aqui apresentado pode ter implicações significativas para o desenvolvimento de novas terapias anti-câncer de base ampla.
UM0112176-um novo inibidor de ALDOA – reduz significativamente o crescimento de células cancerosas
Para perturbar a interacção de ALDOA com os seus parceiros de ligação, utilizámos um inibidor misto de ligação lenta de ALDOA (UM0112176; Suplemento Fig. S1a) que encontrámos através de um rastreio de alto rendimento da grande biblioteca de compostos na Universidade de Montreal. UM0112176 inibiu a actividade humana de ALDOA com IC50 ∼ 2-5 μM de uma forma de ligação lenta (Suplemento Fig. S1b, c), sem inibir outras enzimas glicolíticas (Suplemento Fig. S1d). Verificámos a capacidade do UM0112176 de inibir a actividade da ALDOA in vivo através da determinação dos níveis celulares de fructose-1,6-bisfosfato e triose fosfatos após incubação de células 24-h na presença do inibidor (Suplemento Fig. S1e). Os resultados mostraram um aumento significativo do título do substrato de ALDOA e uma forte diminuição dos produtos de reacção ALDOA tanto em células cancerosas (KLN205, cancro do pulmão de rato) como em células normais (cultura primária de astrocitos de rato). Isto é apoiado pela tendência inversa observada utilizando meios de cultura de células só de glutamina.
Next, determinámos uma curva dose-resposta de UM0112176 e descobrimos que 10 µM UM0112176 reduziu fortemente o crescimento de todas as linhas de células cancerosas testadas: KLN205, hNSCLC (linha de células não pequenas de cancro do pulmão humano), BxPC3 (adenocarcinoma pancreático humano) e AsPC1 (adenocarcinoma ascite do pâncreas humano) (Fig. 1a). A taxa de crescimento das linhas celulares normais (astrocitos de rato, cardiomiócitos de rato-HL-1 e uma linha de células epiteliais humanas-ME16C) praticamente não foi afectada por 10 µM UM0112176 (Fig. 1a). Um tratamento prolongado de 7 dias com 10 µM UM0112176 reduziu o número de células cancerosas quatro vezes, enquanto a contagem de células normais diminuiu apenas 25-30% (Fig. 1b).
a A quantidade de células normais e cancerígenas observadas quando incubadas durante 48 h na presença ou ausência do 10 μM UM0112176 e normalizadas em relação a t = 0. Os valores são dados como média e SD, *p < 0,05 para todas as linhas de células normais e cancerígenas. b A quantidade de células normais e cancerígenas sobreviventes após 7 dias de tratamento com 10 μM UM0112176. Os valores são dados como uma média e SD, *p < 0,05. c O efeito de 10 μM UM0112176 (24 h de tratamento) na expressão Ki67 em KLN205 e astrocitos. A expressão do Ki67 nas células que crescem na ausência do inibidor foi normalizada para ser 100%. Os valores são dados como uma média e SD, *p < 0,05. d A activação da caspase 3 em células KLN205 após tratamento com UM0112176 (10 μM, 24 h). Barra = 20 µm. O gráfico abaixo mostra o número de células com fluorescência caspase 3 activa. e O efeito do UM0112176 na morfologia do citoesqueleto actínico na linha de células cancerosas, KLN205 e hNSCLC, e em células normais, astrocitos e fibroblastos. Bar = 10 µm
Para distinguir se a inibição da taxa de crescimento celular foi devida a mortalidade elevada ou bloqueio na proliferação, testamos a expressão celular de Ki67 (um marcador de proliferação celular) e caspase activa (caspase 3, o efeito final na apoptose). Os resultados revelaram que em células cancerosas, 10 µM UM0112176 (24 h de tratamento) diminuíram fortemente o sinal fluorescente relacionado com Ki67 (Fig. 1c) e elevaram a presença de caspase activa (Fig. 1d). Em células normais, não foram observadas alterações (Fig. 1d) mesmo após tratamento 48-h (Suplemento Fig. S2a).
UM0112176 tratamento perturba o citoesqueleto actínico e altera ROS, potencial da membrana mitocondrial, Ca2+, DSB, e níveis de ATP em células cancerosas mas não normais
Para elucidar o mecanismo da acção UM0112176 examinámos uma série de actividades celulares potencialmente influenciadas pelo inibidor, incluindo a morfologia do citoesqueleto, concentração de ATP, níveis de espécies reactivas de oxigénio (ROS), potencial de membrana mitocondrial e quebra de DNA de dupla cadeia (DSBs). A manifestação mais pronunciada da acção inibidora foi um desaparecimento completo das fibras de stress F-actin no cancro mas não nas células normais após 24 h de incubação com o inibidor (Fig. 1e). Intrigantemente, o início da perturbação da actina polimérica foi muito mais rápido (<5 min) (Suplementar Fig. S3a) do que a inibição total de ALDOA in vitro (∼15 min). Isto suporta a hipótese de que a despolimerização de F-actin não depende da inibição da actividade de ALDOA.
Durante a perturbação do citoesqueleto, observámos uma elevação significativa nos níveis de ROS e cálcio, uma diminuição na concentração de ATP e no potencial da membrana mitocondrial, bem como a indução de quebras de DNA de dupla cadeia (Fig. 2a-e). É importante notar que as alterações induzidas por UM0112176- nas células cancerosas não foram transmitidas (por exemplo, pela libertação de ROS) às células normais: UM0112176-tratamento de células KLN205 co-cultivadas com fibroblastos humanos normais níveis elevados de ROS apenas em células cancerosas (Suplemento Fig. S3b).
UM0112176- alterações induzidas não podem ser explicadas através da inibição da glicólise
Para abordar ainda se as alterações induzidas por UM0112176- podem ser reproduzidas através da inibição da glicólise em células cancerosas, testamos o impacto de outras enzimas efectoras glicolíticas: alizarina vermelha S que inibe o fosfoglicérato mutase (PGAM)18 e 3-PO ((2E)-3-(3-piridinil)-1-(4-piridinil)-2-propen-1-ona) que bloqueia indirectamente a acção da 6-fosfofructo-2-quinase/fructose-bisfosfatase2 (PFK-2)19. A inibição do PGAM resultou num aumento das ROS (Suplemento Fig. S4a) sem efeito no nível de cálcio citoplasmático, enquanto que a inibição dos níveis elevados de PFK-2 de Ca2+ citoplasmático sem alterações nas ROS (Suplemento Fig. S4a, b). Além disso, mesmo as células cancerosas em rápida proliferação (KLN205), foram capazes de manter um nível constante de ATP total (Suplemento Fig. S4c, d) na presença destes inibidores presumivelmente utilizando outros nutrientes, tais como glutamina, em vez de activar a absorção de glucose. É importante notar que nem o 3-PO nem o Alizarin Red S perturbaram o citoesqueleto de F-actin ou induziram DSBs (dados não mostrados).
h3>UM0112176 perturbam as interacções ALDOA-actinas
Aldolase é conhecida por interagir com actina e proteínas de ligação à actina8,9, influenciando a dinâmica do citoesqueleto. Pode inibir a polimerização da actina dependente de WASP14 e levar ao defeito da citocinese20 , mas pode também promover processos dependentes da actina, tais como a motilidade das células cancerígenas adquirida na transição EMT21. Este papel complexo de ALDOA evoca a hipótese de que a ligação UM0112176 a ALDOA pode ser responsável pela perturbação observada do citoesqueleto de F-actin.
A perturbação do citoesqueleto é, contudo, específica da isoforma actina, uma vez que UM0112176 perturbou parcialmente a associação de ALDOA com a forma fibrilar da actina citoesquelética contendo β e γ isoformas (Fig. 3a), não tendo qualquer efeito sobre a estabilidade do músculo (α isómero) polímeros actínicos (dados não mostrados). Em balsas F-actin-aldolase, os contactos F-actin com aldolase encontram-se principalmente em dois loci; a região dos resíduos 1-8 e os resíduos 350-36522. Sondas antigénicas localizadas em locais de ligação apertada para a aldolase em regiões conservadas de microfilamentos de C-terminal de α-actin23. Uma simulação da dinâmica browniana encontrou resíduos de actina semelhantes que participam na ligação à aldolase24. Como as diferenças nos resíduos 1-8 distinguem as isoformas de actina25, a região actina N-terminal conduz assim a uma ligação específica de isoforma com aldolase. Foi também demonstrado que ALDOA interage preferencialmente com a actina γ em pulsões celulares de lisados de células cancerosas do pulmão26 corroborando que o contacto ALDOA com a região terminal N da actina distingue entre as isoformas actínicas.
a O UM0112176- dissociação parcial induzida de ALDOA a partir de γ/γ filamentos de actin in vitro. Os valores são dados como média e SD, *p < 0.05. b O impacto de várias combinações de UM0112176, ALDOA e cofilina na despolimerização de γ/γ actin. c A dissociação de ALDOA induzida por UM0112176- causa o empacotamento F-actin e a despolimerização em células KLN205. d O resultado do acoplamento de UM0112176 a ALDOA utilizando o Autodock. O inibidor UM0112176, e os resíduos C72, K293, e C338 são mostrados em estilo stick, enquanto a dobra de ALDOA é mostrada em estilo cartoon. Todos os átomos de oxigénio são coloridos em vermelho, carbono em verde, átomos de enxofre em amarelo, e átomos de azoto em azul. As cargas na superfície potencial electrostática de ALDOA são representadas em azul para as regiões de carga positiva e vermelho para as regiões de carga negativa. Figura elaborada com PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC.) e, f Apocynin diminui os níveis de ROS induzidos por UM0112176- em células KLN205 e hNSCLC, respectivamente. g Silenciamento NOX1 diminui os níveis de ROS em células KLN205 tratadas com UM0112176. h Sinal fluorescente associado a NOX1 (verde) antes e depois do seu silenciamento em células KLN205. Os núcleos foram contrabalançados com DAPI (azul). Bar = 20 µm. O gráfico à direita mostra uma diminuição da fluorescência associada ao NOX1 após o silenciamento. i A apocinina protege parcialmente o aumento dos níveis de cálcio após o tratamento UM0112716. j O efeito da apocinina na activação da caspase 3. A imagem mostra a activação da caspase 3 (verde) em células KLN205. Bar = 20 µm. k Apocynin impede a perturbação do citoesqueleto de actina em células tratadas com UM0112176. Bar = 20 µm
Interessantemente, o sítio de ligação ALDOA sobrepõe-se ao sítio de ligação da cofilina na actina27,28, uma proteína conhecida por acelerar a despolimerização das fibras de actina29, cuja ligação implica a sobreposição de resíduos de actina N- e C-terminal30. Dadas as grandes formas globulares de ALDOA e cofilina, a extensa sobreposição aparente nos sítios de ligação da actina indica competição por ALDOA e cofilina para os mesmos loci de ligação sobre a actina. A incubação de isoformas F-actin (β-γ) com ALDOA e cofilina (em concentrações de subunidades equimolares) mostrou pouco efeito da cofilina na estabilidade da F-actin (Fig. 3b) indicando que ALDOA protegeu a F-actin contra a acção da cofilina. Isto é consistente com a ligação mais apertada esperada de ALDOA a F-actin23 do que a cofilina que tem uma constante de dissociação estimada de ∼10 μM31. A protecção in vitro por ALDOA contra a despolimerização mediada por cofilina da actina foi abolida com a adição de UM0112176 (Fig. 3b). Embora ALDOA pudesse interagir com a cofilina in vitro, não encontramos provas de que a UM0112176 perturbasse esta interacção (Fig. S2b suplementar). A desestabilização do citoesqueleto de F-actin por UM0112176 deve assim surgir da dissociação de ALDOA dos seus loci de ligação em F-actin que se sobrepõem aos loci de ligação da cofilina, permitindo assim a ligação da cofilina à F-actin e mediando a sua despolimerização. Em consonância com isto, observámos a ausência de colocação de actina citosquelética e ALDOA em células KLN205 tratadas com UM0112176 (Fig. 3c).
Para investigar a interacção de UM0112176 com ALDOA (PDB: 1ZAJ) foi realizada uma análise de acoplamento molecular cego. Os cálculos usando AutoDock32 indicaram 1 maior e 2 menores grupos de pose para UM0112176 em ALDOA. O aglomerado maior continha 17 poses com energia de ligação prevista perto de ∼9.2 kcal/mole enquanto o aglomerado menor tinha cada uma 3 poses de energia de ligação ligeiramente inferior. A inspecção visual coloca a pose superior vicinal a Lys-293 e Cys-338 (Fig. 3d) permitindo aos seus rotamers ligarem-se ao hidrogénio, respectivamente com -C≡N e -Cl grupos funcionais de UM0112176. A modificação de Cys-72 e Cys-338 quer pela sua ligação cruzada33 ou pelo glutatião oxidado inibe a actividade catalítica34 através da comunicação de longo alcance com o local activo ~25Å distante. A inibição de longo alcance de eventos dinâmicos durante a catálise necessária para a actividade de ALDOA por UM0112176, como foi demonstrado para a inactivação oxidada do glutatião ALDOA34, é consistente com a sua cinética de inibição. Intrigantemente, o Lys-293 demonstrou promover γ-actin a interacção com ALDOA, uma vez que a mutação K293A abafa a ligação26. Além disso, os resíduos que compõem a cavidade de ligação UM0112176 sobrepõem-se aos apresentados para raltegravir em ALDOA e o tratamento com raltegravir (100 μM) prolongou a taxa de sobrevivência do rato ∼2-dobrando em relação ao grupo de controlo26 num modelo de cancro do pulmão ortotópico. Hipotejamos que UM0112176 alavanca a capacidade de dissociar ALDOA de γ/γ actin ao competir com γ-actin para a interacção com Lys-293 em ALDOA.
Esta descoberta não explica, contudo, a ausência de acção de UM0112176 sobre a actina citoesquelética em células normais. Evidentemente, em células normais, outras proteínas associadas à actina devem proteger o citoesqueleto contra a despolimerização induzida pela co-polimerização, mas em células cancerosas, esta protecção é aparentemente defeituosa. Procurámos, portanto, factores específicos do cancro que poderiam acelerar a despolimerização do citoesqueleto de F-actin e seriam capazes de induzir a apoptose. Verificámos que um dos efeitos celulares proeminentes da aplicação de UM0112176 foi uma intensificação muito rápida da produção de ROS que ocorreu exclusivamente em células cancerígenas (Fig. 2a). Como o aumento dos níveis de ROS foi concomitante com a modulação da estrutura da fibra F-actin35 , concentrámo-nos nas fontes de ROS associadas ao citoesqueleto, que podem ser específicas para células cancerosas.
Aumento dos níveis de ROS após o tratamento com UM0112176 é causado principalmente pela actividade de NOX
A oxidase dependente deNADPH (NOX) é uma fonte significativa de ROS intracelular que pode ser regulada pelo citoesqueleto actin36. Foi demonstrado que o NOX1 participa na transição epitelial-mesquimal, um processo que facilita a invasão das células cancerígenas37. Assim, colocámos a hipótese de que o deslocamento UM0112176-induzido de ALDOA a partir de actina polimerizada permitiu a desestabilização do citoesqueleto por co-filtração e que a despolimerização subsequente pode ser responsável pelo aumento da ROS. Intrigantemente, na maioria das células cancerosas, as proteínas NOX (especialmente a isoforma NOX1) são expressas a um nível mais elevado do que nas células normais38 (Fig. S2c suplementar). Assim, silenciámos a expressão de NOX1 nas células cancerosas (Fig. 3h) ou inibimos a actividade de NOX1 utilizando a apocinina39. A redução resultante na actividade e expressão de NOX1 bloqueou a elevação induzida pelo UM0112176 dos níveis de ROS (Fig. 3e-g).
Este mecanismo dependente de actina da produção de ROS sugere que o UM0112176 ao estimular o deslocamento de ALDOA dos filamentos de actina permite à cofilina despolimerizar os filamentos de actina e assim, activar o NOX. A produção de ROS por NOX activado, por sua vez, permite a activação redox do homólogo de funda 1 para desfosforizar a P-cofilina40. De facto, a adição de UM0112176 reduziu os níveis celulares de P-cofilina (Suplemento Fig. S5a). ALDOA dissociado dos filamentos de actina pela acção UM0112176 promove a sua despolimerização adicional, libertando locais de ligação adicionais para a co-filtração desfosforilada a ligar com os filamentos. Este mecanismo de avanço explicaria a rápida despolimerização da actina observada nas células KLN205 e hNSCLC.
Surprendentemente, a apocinina apenas parou parcialmente o aumento do nível de cálcio citoplasmático induzido pelo UM0112176 e não protegeu contra a activação da caspase 3 (Fig. 3i, j). Embora a apocinina aparentemente inibisse a perturbação dos filamentos de actina pelo UM0112176, o citoesqueleto apareceu mais agrupado em comparação com as células não tratadas, e as células apresentaram uma morfologia alterada quando foram tratadas simultaneamente com apocinina e UM0112176 (Fig. 3k). A perturbação do citoesqueleto pelo UM0112176 ou em combinação com a apocinina é consistente com a produção de ROS dependente de NOX1 para uma organização citoesquelética adequada nestas células cancerosas.
Mecanismo celular de acção UM0112176 envolve abertura do mitoKATP
Uma proteína que poderia potencialmente ligar o citosqueleto de actina com a produção de ROS mitocondrial e a apoptose é o canal de potássio mitocondrial dependente de ATP (mitoKATP). Uma ligação entre a concentração intracelular de K+ e a apoptose tem sido documentada em muitos sistemas e tem implicado o mitoKATP41. O canal parece ser sensível à despolimerização da actina que aumenta a sua abertura42,43 e resulta em desacoplamento suave e aumento na produção de ROS mitocondrial44. Há, contudo, controvérsia na literatura, com alguns resultados que sugerem que a perturbação da actina fecha o mitoKATP45,
Tratamos previamente células cancerosas com 5HD (5-Hidroxidecanoato), que é conhecido por bloquear a abertura do mitoKATP44, e observámos que o 5HD diminuiu consideravelmente o aumento induzido pelo UM0112176- na ROS (Fig. 4a). 5HD pré-tratamento não foi capaz de bloquear a ruptura do citosqueleto actínico (Fig. 4b) e indução de apoptose por UM0112176, embora tenha abrandado significativamente a taxa de activação da caspase 3 (Fig. 4c). Assim, a despolimerização da actina do citoesqueleto por UM0112176 pode ser responsável pela produção de ROS tanto pela abertura do mitoKATP como, independentemente, pela activação do NOX1 que, por sua vez, potencia a perturbação do citoesqueleto.
a 5HD inibe os níveis de ROS em células KLN205 tratadas com UM0112176. b 5HD não protege contra a perturbação do citoesqueleto de actina (verde) induzida por UM0112176-. c Diminuição da activação da caspase 3 (verde) em células pré-tratadas com 5HD antes da incubação de UM0112176. d, e Ca2+ influxo de fontes externas após estimulação de células UM0112176 de KLN205 e hNSCLC, respectivamente. f, g O efeito da inibição do canal mitoKATP no aumento induzido de células UM0112176 de KLN205 e hNSCLC, respectivamente. h A redução do fluxo de cálcio induzido por UM0112176- após inibição de NCX em células KLN205. i O efeito de UM0112176 nas interacções HK2 (verde) com mitocôndrias (magenta) em células cancerosas de KLN205 e células normais de HL-1. Para melhor visualizar as alterações na localização de HK2 em células KLN205 (o lado esquerdo do painel i), o canal verde (HK2) é apresentado separadamente dos canais magenta (mitocôndria) e azul (núcleos) fundidos. Para células HL-1, a cor branca indica a localização de HK2 verde e de mitocôndrias de cor magenta. Bar = 20 µm
O modo inverso do permutador sódio-cálcio é responsável pelo influxo de cálcio induzido por UM0112176-
UM0112176 ligação a ALDOA foi também associada a um aumento significativo do nível de cálcio celular no cancro mas não em células normais (Fig. 2b). Este aumento foi mais rápido em KLN205 (<5 min) do que em células hNSCLC (~20 min) (Fig. S4g). Procurámos, portanto, a origem deste cálcio e descobrimos que era originário do armazém extracelular (Fig. 4d, e). O esgotamento de Ca2+ do meio de cultura impediu o aumento de cálcio celular induzido pelo UM0112176-.
P>Perguntamos então se NOX1 e mitoKATP poderiam regular sinergicamente as alterações do nível de Ca2+ livre intracelular. De facto, a inibição do NOX1 parcialmente protegido contra o aumento de Ca2+ induzido pelo UM0112176- (Fig. 3i), enquanto a inibição da abertura do mitoKATP praticamente aboliu o aumento (Fig. 4f, g). Uma vez que nenhuma das proteínas funciona como canal de cálcio ou permutador, devem funcionar como reguladores (por exemplo, via ROS) de proteínas directamente envolvidas na homeostase de cálcio.
A activação do NOX pode levar à abertura do mitoKATP que, por sua vez, pode estimular indirectamente o modo inverso do permutador sódio-cálcio (NCXrev), promovendo o influxo de Ca2+ para as células46. Assim, testamos um possível envolvimento do NCX no aumento de cálcio induzido pelo UM0112176. De facto, a inibição do NCXrev por KB-R794346 reduziu o influxo de cálcio (Fig. 4h). Contudo, isto não impediu a indução da apoptose (Suplemento Fig. S5b).
Foi demonstrado que a despolimerização da actina estimula a actividade NCXrev47 o que dá mais apoio à NCX como o permutador responsável pelo influxo de Ca2+ na adição de UM0112176.
Por conseguinte, pode concluir-se que o pé cruzado entre o NOX e o mitocondrial ROS48 activa os transportadores de membrana, o permutador sódio/hidrogénio e o cotransportador sódio/bicarbonato através da estimulação da cascata MAPK sensível à ROS e culmina no influxo de Ca2+ via NCXrev49. Além disso, a sobrecarga citoplasmática de Ca2+ activa a carga de NOX50 e Ca2+ mitocondrial através do uniporter de cálcio mitocondrial acelera a produção de ROS mitocondrial51, criando assim um laço de feedback positivo que mantém níveis elevados de ROS e cálcio e induz a apoptose. A supressão do fluxo de Ca2+ por inibição do NCXrev (Fig. 4h) apoia a noção de que a abertura do mitoKATP levando à libertação de mitoROS no citoplasma52 constitui o evento crucial responsável pela apoptose.
Diminuição dos níveis de ATP específicos das células cancerígenas após inibição de ALDOA induz uma rápida dissociação de HK2 das mitocôndrias
Embora UM0112176 tenha inibido a síntese de ATP em todas as linhas celulares, as alterações de ATP foram maiores e mais rápidas nas células cancerígenas (Fig. 2c). Importante, em células normais mas não cancerosas, estas alterações foram reversíveis após a retirada do inibidor (Suplemento Fig. S4e). A adição de UM0112176 induziu um declínio rápido (<5 min) nos níveis de ATP em células KLN205 (∼20% declínio) e hNSCLC (∼20% declínio) (Suplemento Fig. S4f) enquanto não foram observadas tais alterações em células normais (Suplemento Fig. S4f).
Esta cinética bifásica do esgotamento de ATP induzido por UM0112176- levantou a questão do mecanismo responsável pela rápida diminuição dos níveis de ATP nas células cancerosas. Assim, examinámos a localização subcelular da hexoquinase 2 (HK2) cuja expressão é elevada na maioria das células cancerosas e que requer associação com mitocôndrias para uma actividade plena e uma síntese eficaz de ATP por mitocôndrias4,5. Observámos que no cancro mas não nas células normais, HK2 dissociou-se rapidamente das mitocôndrias após tratamento UM0112176 (Fig. 4i) e o período de tempo destas alterações foi correlacionado com a escala temporal da produção de ROS. Assim, em células cancerosas em rápida proliferação, a primeira fase da diminuição dependente do UM0112176 dos níveis de ATP correlaciona-se com a rápida dissociação de HK2 das mitocôndrias.
O silenciamento da expressão ALDOA (Suplemento Fig. S5c) recapitulou as observações induzidas pelo tratamento UM0112176 (Suplemento Fig. S5d-f) e não mostrou nenhuma diminuição concomitante dos níveis de ATP, de acordo com os resultados relatados por Lew e Tolan14,20. Isto argumenta que a diminuição observada dos níveis de ATP não é consequência de uma menor actividade metabólica, mas tem origem nas interacções de ALDOA com os seus parceiros de ligação que são ab-rogadas por UM0112176. Chang et al. apontaram que a mutação de ALDOA de K293A influencia a interacção de ALDOA com γ-actin mas não implica mudanças no fluxo glicólico26 , apoiando a nossa interpretação de que UM0112176 interfere com as interacções de ALDOA com o luar.
O efeito da UM0112176 nas células cancerosas não pode ser explicado pela acumulação de FBP
Para verificar se as alterações observadas estão associadas à função não metabólica de ALDOA ou se foram consequências da inibição da actividade enzimática e, portanto, da acumulação de FBP, examinámos o efeito da FBP no nível de ROS e ATP, bem como na estrutura do citoesqueleto. Embora a eficiência da difusão transmembrana da FBP seja relativamente baixa, pode ser activa e eficazmente transportada por uma variedade de células53,54. Observámos que 20 mM mas não 5 mM extracelulares de FBP estimularam a produção de ROS e a estrutura do citoesqueleto desestabilizado em células cancerosas (Suplemento Fig. S3c, d), o que é consistente com a comunicação de longo alcance entre o sítio activo aldolase e o locus de ligação UM0112176. As mesmas concentrações de FBP tiveram apenas um efeito menor nas células normais (Suplemento Fig. S3c, d), reflectindo a tendência observada para o tratamento celular com UM0112176. A falta de alterações discerníveis nos astrocíticos concorda com a ausência virtual de NOX1 nestas células (Suplemento Fig. S2c) e reforça a importância da produção de ROS pelo NOX1 em células cancerosas para uma organização citoesquelética adequada. Embora a presença de baixos níveis de NOX1 em células normais que não sofrem apoptose quando tratadas com UM0112176 pudesse argumentar contra o NOX1 conferindo selectividade às células cancerígenas durante o tratamento UM0112176, foi demonstrado que meios de cultura de baixa glucose (5 mM) impediram a isoforma NOX4 de atingir a balsas lipídicas em adipócitos, retendo-a numa fracção de membrana de baixa actividade55. Como as nossas experiências de cultura celular foram conduzidas utilizando concentrações de glucose que modelam o ambiente fisiológico (5 mM), a presença de NOX1 em células normais serve provavelmente alguma outra função não citoesquelética.
UM0112176 impede a localização nuclear de ALDOA
Unexpectedly, o tratamento UM0112176 também resultou no esgotamento de ALDOA a partir de núcleos de células cancerígenas (Suplementar Fig. S5g). Foi demonstrado que a localização de ALDOA nuclear está associada à progressão do ciclo celular17, no entanto, o mecanismo de transporte nuclear de ALDOA e o seu significado para a regulação do ciclo celular requer mais estudos.