Como funciona a tecnologia do ADN recombinante? O organismo em estudo, que será utilizado para doar ADN para a análise, é chamado de organismo doador. O procedimento básico é extrair e cortar o ADN de um genoma doador em fragmentos contendo de um a vários genes e permitir que estes fragmentos se insiram individualmente em pequenas moléculas de ADN abertas, replicando autonomamente tais plasmídeos asbacterianos. Estas pequenas moléculas circulares actuam como portadoras, orvectores, para os fragmentos de ADN. As moléculas vectoriais com os seus insectos são chamadas DNA recombinante porque consistem em novas combinações de DNA do genoma doador (que pode ser de qualquer organismo) com DNA vectorial de uma fonte completamente diferente (geralmente um plasmídeo bacteriano ou um vírus). A mistura de ADN recombinante é então utilizada para transformar células bacterianas, e é comum que moléculas vectoriais recombinantes únicas encontrem o seu caminho em células bacterianas individuais. As células bacterianas são plaqueadas e permitem o seu crescimento em colónias. Uma célula individual transformada com um vector singlerecombinante divide-se numa colónia com milhões de células, todas transportando o mesmo vector recombinante. Portanto, uma colónia individual contém uma grande população de inserções de ADN idênticas, e esta população é chamada clone de ADN. Uma grande parte da análise do fragmento de ADN clonado pode ser realizada na fase em que se encontra no hospedeiro bacteriano. Mais tarde, contudo, é frequentemente desejável reintroduzir o ADN clonado nas células do organismo doador original para realizar manipulações específicas da estrutura e função do genoma. Assim, o protocolo é frequentemente o seguinte:
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Clonagem permite a amplificação e recuperação de um segmento específico de ADN a partir de uma amostra de ADN complexa e em estado de carga, tal como um genoma.
Na medida em que o ADN doador foi cortado em muitos fragmentos diferentes, a maioria das colónias irá transportar um ADN recombinante diferente (ou seja, uma inserção clonada diferente). Portanto, o passo seguinte é encontrar uma forma de seleccionar o clone com a inserção que contém o gene específico no qual estamos interessados. Quando este clone tiver sido obtido, o DNA é isolado em massa e o gene clonado de interesse pode ser sujeito a uma variedade de análises, que consideraremos mais adiante no capítulo. Note-se que o método do clonimétodo funciona porque moléculas individuais recombinantes de ADN entram em células bacterianas individuais, e depois estas células fazem o trabalho de amplificar as moléculas individuais em populações maiores de moléculas que podem ser tratadas como reagentes químicos. A figura 12-1 dá um esboço geral da abordagem.
Figure 12-1
A tecnologia do ADN recombinante permite que fragmentos individuais de ADN de qualquer genoma sejam inseridos em moléculas de ADN vectoriais, tais como plasmídeos, e amplificados individualmente em bactérias. Cada fragmento amplificado é chamado clone de aDNA.
O termo ADN recombinante deve ser distinguido dos recombinantes naturais de ADN que resultam do cruzamento entre cromossomas homólogos em botheukaryotes e prokaryotes. O ADN recombinante, no sentido em que é utilizado neste capítulo, é uma união não natural de DNA recombinante de fontes não homólogas, geralmente de diferentes organismos. Alguns geneticistas preferem o nome alternativo ADN quimérico, depois do monstruoso grego mitológico Quimera. Ao longo dos tempos, a Quimera tem sido o símbolo de uma união biológica impossível, uma combinação de partes de diferentes animais. Da mesma forma, o ADN recombinante é uma Quimera do ADN e seria impossível sem a manipulação experimental que implica a tecnologia do ADN recombinante.
ADN isolante
O primeiro passo para fazer ADN recombinante é isolar o ADN doador e o ADN vectorial. Com a utilização de tais métodos, o grosso do ADN extraído do doador será ADN genómico nuclear em eucariotas ou o ADN genómico principal em procariotas; estes tipos são geralmente os necessários para a análise. O procedimento utilizado para a obtenção do ADN vectorial depende da natureza do vector. Os plasmídeos bacterianos são vectores normalmente utilizados, e estes plasmídeos devem ser purificados longe do ADN genómico bacteriano. Um protocolo para extracção de ADN plasmídeo por ultracentrifugação está resumido na Figura 12-2. O ADN plasmídico forma uma banda distinta de pós-centrifugação por ultracentrifugação num gradiente de densidade de cloreto de césio contendo brometo de etídeo. A banda plasmídica é recolhida perfurando um orifício no tubo de plasticcentrifugação. Outro protocolo baseia-se na observação de que, a um pH alcalino específico, o ADN genómico bacteriano desatura mas os plasmídeos não. A neutralização subsequente precipita o ADN genómico, mas os plasmídeos permanecem em solução.Phages como λ também podem ser utilizados como vectores para clonagem de ADN em sistemas bacteriológicos. O ADN fago é isolado a partir de uma suspensão pura de fagos recuperados do lisado de afagos.
Figure 12-2
Plasmídeos como os que transportam genes de resistência à tetraciclina antibiótica (canto superior esquerdo) podem ser separados do ADN cromossómico bacteriano. Porque a ligação diferencial do brometo deethidium pelas duas espécies de ADN torna o plasmidDNA circular (mais…)
ADN de corte
O avanço que tornou possível a tecnologia do ADN recombinante foi a descoberta e caracterização das enzimas de restrição. As enzimas de restrição são produzidas por bactérias como um mecanismo de defesa contra fagos. As enzimas actuam como tesouras, cortando o ADN do fago e assim inactivando-o. É importante notar que as enzimas de restrição não cortam aleatoriamente; pelo contrário, cortam sequências de alvos de ADN específicos, o que é uma das características chave que as tornam adequadas para a manipulação do ADN. Qualquer molécula de ADN, desde viral a humana, contém sítios alvo de enzimas de restrição puramente por acaso e, portanto, pode ser cortada em fragmentos definidos de um tamanho adequado para clonagem. Os sítios de restrição não são relevantes para a função do organismo, e não seriam cortados in vivo,porque a maioria dos organismos não tem enzimas de restrição.
p>Vejamos um exemplo: a enzima de restrição EcoRI (deE. coli) reconhece a seguinte sequência de seis nucleótidos no ADN de qualquer organismo:
Este tipo de segmento é chamado palíndromo de ADN, o que significa que ambas as cordas têm a mesma sequência de nucleótidos mas em orientação antiparalela.Muitas enzimas de restrição diferentes reconhecem e cortam palíndromos específicos. A enzima EcoRI corta dentro desta sequência mas num par de cortes escalonados entre os nucleótidos G e A.
Este corte escalonado deixa um par de “pontas pegajosas” idênticas de uma só corda. As extremidades são chamadas pegajosas porque podem ligar-se a hidrogénio (stick)a uma sequência complementar. Figura 12-3 mostra o EcoRI a fazer um único corte numa molécula circular de ADN como um plasmídeo: o corte abre o círculo, e a molécula linear formada tem duas extremidades pegajosas. A produção destas extremidades pegajosas é outra característica das enzimas de fricção que as torna adequadas para a tecnologia do ADN recombinante. O princípio é simplesmente que, se duas moléculas diferentes de ADN forem cortadas com a enzima samerestricção, ambas produzirão fragmentos com as mesmas pontas adesivas complementares, tornando possível a formação de quimeras de ADN. Assim, se tanto o vectorDNA como o ADN doador forem cortados com EcoRI, as extremidades pegajosas do vector podem ligar-se às extremidades pegajosas de um fragmento doador quando os dois são misturados.
Figure 12-3
A enzima de restrição EcoRI corta uma molécula circular de ADN com uma sequência alvo, resultando numa molécula linear com pontas pegajosas de uma só corda.
MENSAGEM
As enzimas de restrição têm duas propriedades úteis na tecnologia do ADN recombinante. Primeiro, cortam o ADN em fragmentos de um tamanho adequado para clonagem. Segundo, muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados que criam pontas pegajosas de um só fio conducentes à formação de ADN recombinante.
Dúzias de enzimas de restrição com diferentes especificidades de sequência foram agora identificadas, algumas das quais são mostradas na Tabela12-1. Notar-se-á que todas as sequências alvo são palíndromos, mas, tal como o EcoRI, algumas enzimas fazem cortes escalonados, enquanto que outras fazem cortes de descarga. Mesmo cortes nivelados, que não têm pontas pegajosas, podem ser usados para formar DNA recombinante.
Tabela 12-1
Sítios de Reconhecimento, Limpeza e Modificação de Várias Enzimas de Restrição.
DNA também pode ser cortado por cisalhamento mecânico. Por exemplo, o ADN agitador num misturador irá quebrar as moléculas do tamanho de um cromossoma longo em segmentos de flush-endclonable.
ADN de joeiramento
DN doador e ADN vectorial são normalmente digeridos com a utilização de enzimas de restrição que produzem pontas pegajosas e depois misturadas num tubo de ensaio para permitir que as pontas pegajosas do ADN vectorial e doador se liguem umas às outras e formem moléculas recombinantes. Figura 12-4: Um vector plasmídeo que transporta um único local de restrição EcoRI; assim, a digestão com a enzima de restrição EcoRI converte o ADN circular numa molécula linear com extremidades pegajosas. O ADN doador de qualquer outra fonte (digamos, Drosophila) também é tratado com a enzimaEcoRI para produzir uma população de fragmentos que transportam as mesmas extremidades pegajosas. Quando as duas populações são misturadas, fragmentos de ADN das duas fontes podem unir-se, porque se formam hélices duplas entre as suas extremidades pegajosas. Há muitas moléculas vectoriais abertas na solução, e muitos fragmentos diferentes de ADN deEcoRI doador. Por conseguinte, será produzido um conjunto diversificado de vectores portadores de diferentes inserções de dadores. Nesta fase, embora as pontas pegajosas se tenham unido para gerar uma população de moléculas quiméricas, as espinhas dorsais de fosfato de açúcar ainda não estão completas em duas posições em cadajunção. Contudo, as espinhas dorsais podem ser seladas pela adição da enzima ligase DNA ligase, que cria ligações fosfodiéster nas junções (Figura 12-4b). Certas ligas são mesmo capazes de unir fragmentos de ADN com pontas rombas.
Figure 12-4
Método para gerar um plasmídeo de ADN quimérico contendo genes derivados de ADN estranho. (De S. N. Cohen, “The Manipulation of Genes”, Copyright © 1975 por Scientific American, Inc., S. N. Cohen, “The Manipulation of Genes”. Todos os direitos reservados).
DNA recombinante amplificador
O ADN recombinante ligado entra numa célula bacteriana por transformação. Após itis na célula hospedeira, o vector plasmídico é capaz de se replicar porque o plasmidsnormalmente tem uma origem de replicação. No entanto, agora que a inserção do ADN doador é parte do comprimento do vector, o ADN doador é automaticamente replicado juntamente com o vector. Cada plasmídeo recombinante que entra numa célula irá formar múltiplas cópias de si mesmo nessa célula. Subsequentemente, muitos ciclos de divisão celular terão lugar, e os vectores recombinantes sofrerão mais ciclos de replicação. A colónia de bactérias resultante conterá milhares de milhões de cópias da inserção de ADN do dador único. Este conjunto de cópias amplificadas do fragmento de ADN do doador único o clone de ADN (Figura 12-5).
Figure 12-5
Como funciona a amplificação. O tratamento por restrição enzimática do DNA e vector do doador permite a inserção de fragmentos únicos em vectores. O vector único entra num hospedeiro bacteriano, onde a replicação e divisão celular resultam num grande número de cópias do fragmento doador. (mais…)