Neste post discutimos o fenómeno da difracção de segunda ordem através de um monocromador e os problemas que pode causar na espectroscopia de fluorescência.
Este é o segundo de uma série de posts de blog (ler primeiro post do blog) onde discutimos os erros mais comuns cometidos, e artefactos experimentais que aparecem ao medir espectroscopia de fluorescência. Esta lista foi originalmente inspirada pela ‘Rogue’s Gallery of Fluorescence Artefacts and Errors’ no excelente livro ‘Introduction to Fluorescence’ de David M. Jameson.1 Estes posts no blogue serão baseados nessa lista com a experiência dos nossos próprios engenheiros de operações e cientistas de aplicações dos erros comuns que observam ao responder às perguntas dos clientes, visitando laboratórios e… ocasionalmente fazendo-nos.
O que é Difracção de Segunda Ordem?
Na espectroscopia de fluorescência os monocromadores são usados para seleccionar os comprimentos de onda de excitação e emissão. Um espectrómetro de fluorescência típico será constituído por dois monocromadores; um monocromador de excitação para seleccionar o comprimento de onda de excitação desejado e um monocromador de emissão para seleccionar o comprimento de onda que atinge o detector. Para mais informações sobre como funciona um espectrómetro de fluorescência leia o nosso artigo “Introdução às Medidas de Fluorescência &Instrumentação”.
Monocromadores utilizam grelhas de difracção a fim de isolar o comprimento de onda desejado da luz de banda larga incidente. A luz de banda larga brilha na grelha de difracção e os diferentes comprimentos de onda que compõem a luz são difraídos em ângulos diferentes a fim de satisfazer a equação da grelha,
onde m é a ordem da difracção, λ é o comprimento de onda da luz difratada, d é o espaçamento das ranhuras da grelha, é o ângulo entre a luz incidente e a normal da grelha, θί é o ângulo entre a luz difratada e a normal da grelha. Pode-se ver que para cada comprimento de onda constante da luz será difratada num ângulo diferente, o que permite ao monocromador isolar o comprimento de onda desejado. Também se pode ver que para constante e constante λ a equação está satisfeita com ângulos diferentes dependendo da ordem de difracção m que pode tomar valores inteiros positivos e negativos (…-2, -1, 0, 1, 2…). Um valor de ±1 é denominado de difracção de primeira ordem e ocorre closet à normal e é o mais alto em intensidade. Do mesmo modo, um valor ±2 é conhecido como difracção de segunda ordem e ocorre num ângulo menos profundo e tem uma intensidade mais fraca. A difracção de ordem superior segue um padrão semelhante de aumento do ângulo afastado do normal e redução da intensidade.
Num monocromador é apenas a difracção de primeira ordem (+1 ou -1) que é utilizada para seleccionar o comprimento de onda desejado e as ordens superiores são indesejadas. No entanto, devido à ampla gama de comprimentos de onda a serem difraídos, as gamas de ângulo ocupadas pela difracção de primeira e segunda ordem não são únicas. Isto é ilustrado na Figura 1 onde o cone azul representa a gama de ângulos onde a luz é difratada de primeira ordem e o cone vermelho é a gama de ângulos onde a luz foi difratada de segunda ordem e existe uma região de sobreposição partilhada entre estas gamas. Este alcance partilhado também pode ser visto a partir da equação da grelha. Considere-se luz a 600 nm que é difratada de primeira ordem (m = 1, λ = 600 nm) e luz a 300 nm que é difratada de segunda ordem (m = 2, λ = 300); é claro que o lado esquerdo da equação da grelha é o mesmo para ambos os casos e o ângulo da luz difratada deve, portanto, ser equivalente. A consequência disto é que quando o monocromador é ajustado para transmitir 600 nm, uma pequena fracção de 300 nm de luz será também transmitida, o que pode ser problemático para a espectroscopia de fluorescência.
Aspecto da Difracção de Segunda Ordem em Espectros de Fluorescência
a Difracção de segunda ordem é um problema particular para a dispersão de amostras tais como pós, cristais, e suspensões coloidais. Para mostrar o efeito que a difracção de segunda ordem tem nos espectros de fluorescência, foi preparada uma amostra fluorescente de dispersão misturando uma solução de corante fluorescente 2-aminopiridina com Ludox que é uma suspensão coloidal de nanopartículas de sílica e serve como dispersor. A solução foi excitada a 300 nm e o espectro de emissão medido numa gama de 250 nm a 950 nm, como mostra a figura 2, utilizando o Espectrómetro de Fotoluminescência FLS1000 com o filtro de ordenação (ver secção seguinte) do monocromador de emissão desactivado. O primeiro pico a 300 nm corresponde à dispersão de Rayleigh da luz de excitação de 300 nm que foi difratada de primeira ordem no monocromador de emissão. Segue-se a primeira ordem de fluorescência da 1-aminopiridina que atinge o pico de 380 nm. Estes picos são então repetidos como artefactos de segunda ordem com um pico de dispersão de Rayleigh a 600 nm e um pico de fluorescência a 760 nm. Um fraco pico de dispersão de Rayleigh de terceira ordem também pode ser visto apenas a 900 nm. Errar os artefactos de segunda ordem como verdadeira emissão de fluorescência é um erro comum entre utilizadores inexperientes de fluorescência e tem sido mesmo a causa de relatos errados na literatura. Um exemplo disto é a publicação de um artigo que relatou novas bandas fracas de emissão de longo comprimento de onda de triptofano e tirosina a 675 nm e 600 nm que se juntavam à conhecida emissão UV destes resíduos proteicos.3 Seis meses depois Hutnik et al. publicaram uma refutação que mostrou que a suposta fluorescência de onda longa era simplesmente a difracção de segunda ordem da verdadeira emissão UV de triptofano e tirosina a 340 nm e 300 nm.4
Remoção da difracção de segunda ordem utilizando filtros de ordenação
Misturar e publicar um artefacto de segunda ordem é um exemplo extremo, mas um problema mais comum é que a dispersão de segunda ordem sobrepõe-se frequentemente à emissão de fluorescência que está a ser medida e distorce o espectro. A Figura 3a mostra o espectro de emissão da mesma amostra de Ludox / 2-aminopirida que foi utilizada na Figura 2 mas o comprimento de onda de excitação foi deslocado para 240 nm e a gama de emissão foi reduzida. A dispersão de segunda ordem está agora a 480 nm e sobrepõe-se à cauda da fluorescência de 2-aminopiridina, o que impede a medição precisa do espectro. A solução para este problema é utilizar filtros de ordenação no interior do monocromador. Os filtros de ordenação são filtros de passagem longa que apenas transmitem comprimentos de onda acima do comprimento de onda de corte do filtro. O princípio dos filtros de ordenação no interior do monocromador é ilustrado na Figura 4, onde os filtros de ordenação são montados numa roda de filtragem localizada em frente da fenda de saída. Quando o monocromador está configurado para transmitir 300 nm, a grade de difracção é rodada de modo a que a luz difracta de 300 nm seja direccionada para a fenda de saída do monocromador e a roda do filtro é rodada de modo a que não haja filtro de passagem longa no percurso da luz e a luz de 300 nm seja emitida pelo monocromador conforme desejado (imagem à esquerda). Quando o monocromador é ajustado para transmitir 600 nm de luz, a grade de difracção é rodada de modo a que a luz difraída de 600 nm de primeira ordem seja direccionada para a fenda de saída, que é acompanhada por uma pequena quantidade de luz de segunda ordem de 300 nm. A roda do filtro é rodada de modo a que haja um filtro de passagem de 400 nm de comprimento em frente da fenda de saída que transmite a luz desejada de 600 nm enquanto bloqueia a luz indesejada de 300 nm (imagem da direita).
O benefício de ordenar filtros de ordenação é mostrado na Figura 3b, onde o espectro foi remensurado com a roda de classificação automática de ordenação do monocromador de emissão do FLS1000 agora activado. O filtro de ordenação remove o pico de dispersão de segunda ordem a 480 nm e obtém-se o verdadeiro espectro de 2-aminopiridina. Os espectrómetros FLS1000 e FS5 da Edinburgh Instruments estão equipados com rodas filtrantes de ordenação tanto nos monocromadores de excitação como nos monocromadores de emissão como padrão. Estas rodas de filtro são activadas por defeito e são totalmente automatizadas, com o software Fluoracle® do FLS1000 e FS5 a seleccionar os filtros apropriados a utilizar com base na escolha do comprimento de onda de excitação e dos comprimentos de onda de emissão. Estas rodas de filtro automático permitem ao utilizador medir espectros de fluorescência amplos sem nunca se preocupar com artefactos de segunda ordem distorcendo as suas medidas.
Esperamos que este post no blogue o tenha ajudado a compreender a presença de artefactos de segunda ordem em espectros de fluorescência e como podem ser evitados através da utilização de filtros de ordenação.
- Introdução à Fluorescência, D. M. Jameson, CRC Press (2014)
- Princípios da Espectroscopia de Fluorescência 3rd, J. R. Lakowicz, Springer (2006)
- Macías, M. C. Pinto, C. Gutiérrez-Mérino, Fluorescência de Longo Comprimento de Onda de Tirosina e Soluções Triptófanas, Biochem Int. 15, 961-969 (1987)
li>M. Hutnik, A. G. Szabo, Fluorescência de Longo Comprimento de Onda de Tirosina e Triptofano: a Classic Example of Second Order Diffraction, Biochem Int. 16, 587-591 (1988)
Spectrómetros de Prevenção de Difracção de Segunda Ordem
Os espectrómetros FS5 e FLS1000 definem o padrão em estado estacionário e espectroscopia de fotoluminescência resolvida no tempo tanto para investigação fundamental como para aplicações laboratoriais de rotina. Para mais informações sobre os nossos FLS1000 e FS5, porque não contactar um membro da nossa equipa em [email protected].
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