Ultravioleta-visível, ou UV-Vis, a espectroscopia é uma das técnicas analíticas mais populares no laboratório.
Na espectroscopia UV-Vis, a luz é passada através de uma amostra a um comprimento de onda específico no espectro UV ou visível. Se a amostra absorver alguma da luz, nem toda a luz passará, ou será transmitida. A transmissão é a razão entre a intensidade da luz transmitida e a luz incidente, e está correlacionada com a absorvância. A absorvância pode ser utilizada de uma forma quantitativa, para obter a concentração de uma amostra. Pode também ser utilizada de forma qualitativa, para identificar um composto, fazendo corresponder a absorvância medida ao longo de uma gama de comprimentos de onda, denominada espectro de absorvância, aos dados publicados. Este vídeo irá introduzir a espectroscopia UV-Vis, e demonstrar a sua utilização em laboratório na determinação da concentração e cinética de reacção da amostra.
Quando um fotão atinge uma molécula e é absorvido, a molécula é promovida do seu estado de solo para um estado de energia mais elevado. A diferença de energia entre as duas é a diferença da banda. A energia do fóton deve corresponder exactamente ao intervalo da banda para que o fóton seja absorvido. A estrutura química determina o intervalo da banda; portanto, cada molécula tem espectros de absorção únicos.
Absorbância segue a Lei da Cerveja, cujo estado de absorção é igual ao coeficiente de atenuação molar vezes o comprimento e concentração do trajecto. O coeficiente de atenuação molar está relacionado com a capacidade do composto individual de absorver a luz de um comprimento de onda específico. O comprimento do trajecto refere-se à distância percorrida pela luz através da amostra, que é tipicamente de 1 cm para as cuvetes normais. A lei da cerveja pode ser usada para calcular a concentração da amostra, se a capacidade de absorção for conhecida, ou pode ser usada uma curva de calibração.
UV-Vis é muitas vezes chamada técnica geral, uma vez que a maioria das moléculas absorve a luz na gama de comprimentos de onda visíveis à luz UV. A gama de UV estende-se de 100-400 nm, e o espectro visível varia de 400-700 nm. No entanto, a maioria dos espectrofotómetros não funciona na gama UV profunda de 100-200 nm, uma vez que as fontes de luz nesta gama são dispendiosas. A maioria dos espectrofotómetros UV-Vis usa uma lâmpada de deutério para a gama UV, que produz luz de 170-375 nm, e uma lâmpada de filamento de tungsténio para a gama visível, que produz luz de 350-2.500 nm.
Desde que a fonte de luz é geralmente uma lâmpada com amplas gamas de comprimento de onda, o comprimento de onda específico de absorção é seleccionado usando filtros ou um monocromador. Um monocromador é um dispositivo que separa os comprimentos de onda da luz espacialmente, e depois coloca uma fenda de saída onde se encontra o comprimento de onda de luz desejado. O monocromador pode ser digitalizado sobre uma gama de comprimentos de onda para fornecer todo um espectro de absorção. Isto torna a técnica útil para quantificar e identificar uma vasta gama de moléculas.
Agora que os princípios básicos da espectroscopia UV-Vis tenham sido delineados, vamos dar uma olhada a uma simples experiência UV-Vis em laboratório.
Antes de iniciar a medição, ligue o espectrofotómetro, e permita que as lâmpadas aqueçam durante um período de tempo apropriado para as estabilizar.
Preparar um branco enchendo uma cubeta limpa com o solvente da amostra, e depois limpar o exterior com papel sem fiapos para remover quaisquer impressões digitais.
Cuidar que a cubeta esteja devidamente alinhada com quaisquer lados ranhurados fora do percurso do feixe, e inseri-la no espectrofotómetro. Fixar a tampa para evitar que a luz ambiente entre no sistema.
Medir a absorvância do branco a um comprimento de onda, ou sobre um intervalo de comprimento de onda. Registar ou guardar a absorvância, pois esta deve ser subtraída da absorvância da amostra.
P>Próximo, descarte o branco e lave a cubeta duas vezes com a amostra. Em seguida, encher a cubeta cerca de ¾ cheio com amostra. Limpar novamente o exterior da cubeta, para assegurar que está limpa e livre de impressões digitais.
Colocar a cubeta no espectrofotómetro na orientação correcta, e fixar a tampa.
Colher uma medida de absorvância ou espectro no mesmo comprimento de onda ou intervalo de comprimento de onda que o branco. Subtrair o espectro ou medição em branco, se o instrumento não o fizer automaticamente.
Do espectro de absorvância recolhido, determinar a absorvância máxima, ou λmax.
Para quantificar a quantidade de substância a analisar na amostra, criar uma curva de calibração utilizando um intervalo de concentrações conhecidas de substância a analisar. Para mais informações sobre como construir e utilizar uma curva de calibração, por favor veja o vídeo desta colecção “Curvas de Calibração”.
A medição da absorvância também pode ser utilizada para calcular a cinética da reacção medindo o aumento ou a diminuição de uma concentração de compostos ao longo da reacção. Comece por fazer uma leitura inicial da amostra, corante azul neste caso, no máximo da absorvância antes da reacção.
P>Próximo, adicione rapidamente o reagente, lixívia neste caso, para iniciar a reacção química. Agitar bem, para que se misture com a amostra.
Medir a absorvância ao máximo da absorvância ao longo do tempo.
O espectro inicial da absorvância da amostra de corante azul é mostrado. As cores de fundo mostram as cores da luz no espectro visível. O corante azul tem uma absorvância máxima a cerca de 630 nm.
A cinética da reacção entre o corante azul e a lixívia foi medida ao longo do tempo. A absorvância do corante azul diminui com o tempo, uma vez que reage com a lixívia. A absorvância atinge quase zero após 300 s, indicando que a reacção está quase completa. Para mais informações sobre cinética e reacções, por favor veja o vídeo JoVE Science Education “Reaction Rate Laws”.
UV-Vis spectroscopy é fortemente utilizado em muitas áreas de investigação diferentes para identificar ou quantificar uma amostra.
Por exemplo, a espectroscopia UV-Vis é fortemente utilizada em campos biológicos para quantificar a quantidade de proteína numa amostra. Um ensaio de Bradford é frequentemente utilizado para quantificar proteínas, com a ajuda de um corante. Primeiro, é preparada uma curva de calibração de concentrações de proteínas conhecidas, tipicamente utilizando albumina de soro bovino, ou BSA. Em seguida, adiciona-se uma coloração azul Coomassie a cada um dos padrões e à amostra. A absorvância do complexo proteína-dye é então medida a 595 nm.
Alternativamente, as proteínas podem ser medidas directamente pela sua absorvância a 280 nm. Neste exemplo, a concentração de proteínas é quantificada utilizando um espectrofotómetro de volume ultra baixo. Para muitas proteínas, uma absorvância de 1 corresponde a uma concentração de 1 mg/mL.
UV-Vis espectroscopia é também utilizada para quantificar a quantidade de células bacterianas numa cultura celular. Para esta medição, a absorvância, ou densidade óptica, é medida a 600 nm. Tipicamente, uma medição OD600 de 1 indica a presença de 8 x 108 células bacterianas por mL. A medição da densidade celular ao longo do crescimento da cultura permite a determinação da curva de crescimento bacteriano, e pode ajudar a identificar quando uma cultura está na sua fase exponencial de crescimento.
Óxido de nitrogénio e dióxido de azoto, ou NOx, é um subproduto do escape de automóveis, e pode ser prejudicial para o ambiente porque forma ozono troposférico prejudicial. O NOx pode ser medido reagindo-o com uma solução de ácido sulfanílico e naftil-etilenodiamina. A solução resultante é uma molécula de corante azo de cor rosa, cuja intensidade está directamente correlacionada com a concentração de NOx. Esta concentração pode então ser determinada utilizando um espectrofotómetro UV-Vis.
Acabou de assistir à introdução de JoVE à espectroscopia visível UV. Deve agora compreender as bases do funcionamento do UV-Vis, como medir uma amostra usando um UV-Vis e como correlacionar a absorção com a concentração da amostra.
P>Espectrofotómetro de UV-Vis.