Resultados e Discussão
A nossa abordagem para avaliar a nucleação da hélice utiliza o substituto da ligação de hidrogénio (HBS) α-helices em que a ligação de hidrogénio da cadeia principal N-terminal é substituída por uma ligação covalente (Fig. 1B) (20). Em relatórios anteriores, descrevemos hélices HBS em que a ligação de hidrogénio é substituída por uma ligação de carbono-carbono (21). A caracterização destas hélices sintéticas por espectroscopia CD e 2D-NMR, bem como a análise de difracção de raios X de cristal único, revela que elas imitam fielmente a conformação das hélices canónicas α-helices (21, 22). É importante notar que os HBS helices são capazes de inibir as interacções proteína-proteína intracelular mediadas por α-helices, apoiando a hipótese de que estes compostos reproduzem a estrutura e função da proteína α-helices (23, 24). Para analisar o efeito de diferentes resíduos na formação da hélice α, preparámos uma HBS análoga a uma ligação de dissulfureto, cujas taxas de formação poderiam ser monitorizadas em condições aquosas (25). Conjecturámos que as taxas de formação desta ligação forneceriam uma sonda única para examinar parâmetros biofísicos relacionados com a formação da hélice. Como a ligação dissulfido-HBS (dsHBS) imita a ligação intramolecular de hidrogénio em α-helices, formulámos a hipótese de que a oxidação do bistiol (bt) ao dissulfide (ds) forneceria uma medida directa da nucleação da hélice (Fig. 1C). As taxas de formação de hélice para os peptídeos modelo foram medidas por espectroscopias ultra-rápidas e queda na gama de nanossegundos (14, 26⇓⇓-29). As taxas de formação de dissulfeto são muito mais lentas (na ordem dos minutos) sob as nossas condições de reacção (30). A escala de tempo dramaticamente mais lenta para a formação de dissulfuretos sugere que as diferenças dependentes de sequência na taxa de formação de dissulfuretos reflectem populações préequilibradas: os resíduos com maior propensão de nucleação favorecem a formação de dissulfuretos.
Os hélices HBS ligados por dissulfuretos podem ser derivados da oxidação dos peptídeos de bistiol pai, permitindo uma abordagem fácil para controlar a conformação do peptídeo (31⇓⇓-34). Baseámos o nosso desenho inicial do peptídeo num pequeno segmento do domínio de activação p53: XQEG*FSDLWKLLS (1), onde X e G* representam os resíduos dsHBS-constrained (35). A sequência p53 foi escolhida porque tem relativamente poucos contactos de cadeia lateral como pontes iónicas, o que pode enviesar os resultados. Já caracterizámos anteriormente vários análogos p53 HBS por espectroscopias de CD e NMR que nos permitem prever potenciais problemas de agregação que podem afectar as construções estabilizadas (36⇓-38). O peptídeo bistiol p53 é fracamente helicoidal em tampões aquosos a 295 K. A espectroscopia de CD (Fig. 2A) mostra que o p53 dsHBS 1 é altamente helicoidal em comparação com o peptídeo de base (25). Seleccionámos A, G, D, I, K, L, P, e V como os resíduos convidados para esta investigação. Esta selecção inclui correntes retas alifáticas representativas e resíduos ramificados β juntamente com correntes laterais carregadas positiva e negativamente.
Análise conformacional e síntese de peptídeos sem restrições. (A) A espectroscopia CD sugere que o peptídeo de HBS dissulfidado (ds) é altamente helicoidal em comparação com o bistiol (bt) pai. Os estudos do CD foram realizados com 50 peptídeos μM em PBS de 1 mM. (B) Estruturas derivadas de NMR de ds-2A. Vistas de 20 estruturas de energia mais baixa são mostradas com átomos de carbono, azoto e oxigénio em cinza, azul, e vermelho, respectivamente. A ligação do dissulfureto é mostrada na cor amarela. (C) Esquema para a reacção de oxidação. A conversão de bt-2Λ → ds-2Λ foi afectada em condições oxidativas suaves; o bistiol não reagido foi extinto com maleimida 3.
Após experiências iniciais, o peptídeo 1 foi modificado substituindo os resíduos nativos de ácido glutâmico e fenilalanina por lisina e alanina, respectivamente, para obter 2Λ: XΛKG*ASDLWKLLS. A nova sequência foi concebida para evitar potenciais interacções em cadeia lateral entre os resíduos convidados (Λ) e a posição i + 3 correspondente; a lisina foi incorporada para aumentar a solubilidade da água do hospedeiro. A segunda posição foi escolhida para a introdução dos hóspedes porque a conformação deste resíduo está implicada na indução da hélice perto do terminal N (39, 40). A conformação helicoidal do ds-2A: XAKG*ASDLWKLLS foi avaliada usando uma combinação de 1D NMR, espectroscopia de correlação total, e espectroscopia de correlação do efeito de Overhauser (ROESY) em soluções aquosas (Texto SI, Tabela S1, e Fig. S1). Os espectros ROESY revelaram efeitos de Overhauser nuclear (NOE) de picos cruzados indicativos de uma estrutura helicoidal, incluindo NH-NH sequencial (i e i + 1) e vários NOEs de maior alcance (entre i e i + 3/i + 4) (Texto SI, Tabela S2). É importante notar que todos os ângulos diédricos da espinha dorsal ϕ, calculados a partir das constantes de acoplamento 3JNHCHα, estão na gama esperada para conformações helicoidais (Texto SI, Tabela S1) (41, 42). As constantes de acoplamento observadas para os resíduos dentro do macrociclo não diferem do resto da cadeia, indicando que a restrição do dissulfeto está a induzir fielmente uma conformação helicoidal α. A estrutura da solução de ds-2A foi determinada a partir de 48 picos cruzados ROESY e 11 ângulos calculados ϕ usando a pesquisa conformacional de Monte Carlo no Macromodel 2014. Uma sobreposição das 20 estruturas de energia mais baixas para ds-2A é mostrada na Fig. 2B. Notavelmente, a macrocicleta com deformação dissulfídica não perturba o terminal N do α-helix. Em geral, juntamente com a espectroscopia CD, os estudos de RMN confirmam a estabilização de uma conformação celular importante α-aformação celular em peptídeos com restrições dsHBS.
Os peptídeos de bistiol e HBS foram sintetizados como se mostra no texto SI, Fig. S2. Utilizámos condições de oxidação suave consistindo em 2% (vol/vol) de DMSO para oxidar os bistióis (Fig. 2C) (25, 30). Para separar os peptídeos de bistiol e dsHBS estreitamente relacionados no HPLC e para saciar os grupos de thiol, tratámos a mistura de reacção com um derivado maleimida (43). A separação adequada do bistiol e dos peptídeos dissulfídicos sobre HPLC permitiu-nos quantificar as taxas de formação de dissulfeto para cada sequência a partir da análise das áreas de pico de HPLC (Fig. 3A e Fig. S3). As taxas iniciais de formação de bissulfuretos são traçadas na Fig. 3B, e os dados tabulados são apresentados na Tabela 1.
Análise de conversão do bistiol em dissulfureto. (A) As taxas de conversão bt-to-ds foram analisadas por HPLC, tendo o triptofano como controlo interno. Resultados representativos da HPLC para o peptídeo 2 com alanina (Λ = A) como o resíduo convidado são mostrados. (B) Lotes de conversão de bt-to-ds para diferentes resíduos de hóspedes. (C) Espectros de CD de sequências com diferentes resíduos de hóspedes ilustram que o conteúdo helicoidal da maioria das sequências, com excepção das sequências com Λ = G, P, e D, é idêntico. Os estudos em CD foram realizados com 50 peptídeos μM em 5 mM KF, pH 7.3.
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Comparação da taxa de formação de dsHBS com valores de propensão de hélice da literatura
Verificamos que a propensão de nucleação da alanina é mais forte do que a da glicina, enquanto que a formação de ligação de dissulfeto com prolina como hóspede é demasiado lenta para ser medida com precisão. Estes resultados são consistentes com as relações conhecidas: a glicina é um resíduo altamente flexível, enquanto que a prolina ajuda a helicicultura apenas como um resíduo de N-cap e não em outras posições na hélice. Estes resultados indicam também que a conformação do macrociclo influencia as taxas de formação do dissulfureto. Se as taxas de formação da ligação fossem independentes da conformação do macrociclo, a substituição de uma única glicina no lugar de uma alanina não causaria um efeito significativo. É provável que a cadeia do peptídeo para além do suposto macrociclo esteja a influenciar a conformação de préequilíbrio, mas como o peptídeo de bistiol é largamente nãoα-helical, esperamos que este efeito seja subtil e equivalente para cada mutante.
Sequências de leucina e alanina são semelhantes nas suas taxas de formação de dissulfureto, como seria de esperar dos valores de propensão da literatura (Tabela 1) (6). Estes resultados fornecem métricas úteis para medir o potencial do nosso modelo sintético como uma sonda de nucleação da hélice. Surpreendentemente, as nossas investigações revelam que os resíduos ramificados em β não são prejudiciais à nucleação da hélice em α. De facto, a taxa de formação de dissulfeto com valina é quase igual à da alanina e leucina, enquanto que a isoleucina leva a uma ligeira diminuição. Resíduos carregados, lisina e aspartato, diminuem a taxa de reacção ao nível de glicina. Como o ácido aspártico é um quebra-hélice conhecido, enquanto a lisina é considerada como um resíduo estabilizador da hélice (44, 45), estes resultados sugerem que os resíduos carregados participam potencialmente em interacções de longo alcance. Embora as sequências deste estudo tenham sido concebidas para minimizar a dependência do contexto, as interacções da espinha dorsal não podem ser completamente descartadas. A espectroscopia CD mostra que cinco das oito sequências dsHBS têm um conteúdo helicoidal muito semelhante; a substituição da glicina, da prolina e do ácido aspártico baixa a helicidade (Fig. 3C). Conjecturamos que a estabilidade helicoidal da sequência condicionada não é um determinante importante da formação da taxa de dissulfureto. A comparação das sequências de lisina e ácido aspártico fornece apoio a esta hipótese, porque estas sequências apresentam taxas semelhantes de formação de dissulfuretos, enquanto os peptídeos condicionados mostram diferentes estabilidades helicoidais. Os resíduos carregados no final das hélices podem influenciar positiva ou negativamente a estabilidade da hélice com base nas suas interacções com o macrodipolo da hélice (46). Contudo, tais interacções macrodipolares não devem influenciar o processo de nucleação da hélice porque a hélice ainda não está organizada.
Para obter apoio teórico para as nossas observações experimentais, calculámos barreiras de activação para a formação de uma ligação de hidrogénio i a i + 4 em sequências de peptídeos utilizando simulações de metadinâmica (47, 48). As transições helicoidais foram previamente investigadas utilizando simulações molecular-dinâmicas para analisar a propensão à hélice e os tempos de nucleação, mas, tanto quanto sabemos, o efeito das mutações pontuais na nucleação da hélice não foi explorado de forma sistemática (28, 39, 49). Determinámos o impacto de diferentes resíduos na formação de uma volta α numa sequência de peptídeo modelo acetilado e metilamidated, Ac-AΛA-NHMe. Utilizámos a distribuição de Desmond 3.1 (50) de Schrodinger em 2012 para realizar uma simulação de 50ns de metadinâmica sobre o tripéptido utilizando o campo de força Amber ff12SB e parâmetros de iões monovalentes associados (51, 52). Foram determinadas superfícies bidimensionais de energia livre e as energias de activação foram identificadas por inspecção (Fig. 4). As energias de activação estabilizaram à medida que o comprimento da simulação aumenta, sugerindo que a simulação convergiu a 15 ns (Fig. S4). Também realizámos as simulações em triplicado e medimos a rmsd média entre as superfícies de energia livre resultantes (Fig. S4). A análise revela que todos os resíduos de hóspedes (Λ), excepto a prolina, amostras de ângulos diedros correspondentes à esquerda e à direita α-helix, β-strand, e poliprolina II (PPII) da parcela Ramachandran (Fig. 4A). A parcela da prolina contendo tripéptido apresenta apenas os mínimos α e PPII (Fig. 4B). As parcelas para os outros 18 resíduos convidados em Ac-AΛA-NHMe são mostradas na Fig. S5. A fracção ponderada das populações α, β, e PPII para os diferentes resíduos de hóspedes é plotada na Fig. 4C. Para calcular a barreira para a formação da hélice, comparamos a altura do pico mais curto entre a bacia de energia mais baixa correspondente ao PPII ou β ângulos diedros para o α-helical dihedral para cada resíduo (Fig. 4D). Nos nossos cálculos, os ângulos diedros PPII foram encontrados como sendo a mais baixa conformação energética para a maioria dos resíduos convidados.
Resultados da simulação de metadinâmica para avaliar a barreira à formação de uma ligação de hidrogénio i a i + 4 num peptídeo modelo (AcAΛA-NHMe) em função dos diferentes resíduos de hóspedes. (A e B) Superfícies bidimensionais de energia livre para Λ = alanina e prolina são mostradas com as outras incluídas no Texto SI. As parcelas Ramachandran de todos os resíduos mostram bacias de baixa energia para o α, β, e o espaço diádrico poliprolina II (PPII), com excepção da prolina, onde os espaços PPII e α dominam. (C) Populações ponderadas de todas as bacias de baixo consumo de energia correspondentes aos ângulos da catedral de α, β, e PPII. (D) A barreira energética de activação entre a região de energia mais baixa correspondente ao espaço PPII e α- ângulos clédricos diatéricos.
Os resultados destes cálculos correlacionam-se com os dados experimentais e sugerem que a barreira à pré-organização da conformação clédrica α- não segue as escalas de propensão. Embora as energias de activação reflictam as populações iniciais e os perfis energéticos das conformações α e β ou PPII, fornecem um indicador para estimar a dificuldade dependente dos resíduos de adoptar uma conformação α-helical. Os valores calculados ∆G‡ identificam os resíduos dos hóspedes com taxas de dobragem rápidas e lentas, mas sugerem que as taxas de vários outros não são facilmente distinguíveis. Em geral, os cálculos apoiam as observações experimentais de que as escalas de propensão helicoidal não são aplicáveis à nucleação da hélice.