Como as proteínas Rb controlam a proliferação celular não é completamente compreendida. Foi estabelecido que a proteína RB se associa a uma grande variedade de factores de transcrição e complexos associados à cromatina.
A ligação da proteína Rb inibe a capacidade de activação transcripcional dos factores E2F, mascarando o domínio de activação transcripcional e, em alguns casos, convertendo os factores E2F em repressores de transcrição. A importância da interacção Rb-E2F no controlo do crescimento celular é demonstrada pela descoberta de que todos os mutantes Rb naturais isolados de tumores humanos carecem da capacidade de ligação e regulação negativa do E2F (Qian et al.., 1992).
Proteínas Rb são pensadas para inibir a expressão dos genes regulados por E2F de duas formas (Dyson et al., 2002): ligando directamente e bloqueando o domínio de activação das proteínas E2F ou através da repressão activa através do recrutamento de HDAC, factores SWI/SNF, proteínas do grupo Polycomb (Dahiya et al., 2002), 2001) ou metiltransferase (Vandel et al., 2001): por ligação directa e bloqueio do domínio de activação das proteínas E2F (Dahiya et al., 2001), 2001).
Ligação a factores de transcrição E2F
A família E2F de factores de transcrição consiste em pelo menos sete membros da família E2F, E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5, 2A7E e E2F7.
Um factor de transcrição E2F funcional consiste num heterodímero contendo um polipéptido E2F e um polipéptido DP (Helin et al.., 1993). Cada um dos polipeptídeos E2F pode heterodimerizar com DP1 ou DP2 (DP3) (Ormondroyd et al., 1995), embora o factor de transcrição E2F7 ligue o ADN de uma forma independente de DP.
Existem diferenças funcionais e estruturais dentro da família E2F. E2F1, E2F2 e E2F3 são activadores transcripcionais, que interagem com pRB. E2F4 e E2F5 são repressores transcripcionais e na sua maioria ligam Rb2/p130 e p107 (Gaubatz et al., 2000). 2A7E parece não ter um domínio de interacção de proteínas de bolso; interage com as proteínas Polycomb e reprime a transcrição (Morkel et al., 1997). Acredita-se também que os recentemente identificados E2F7 e E2F8 reprimem promotores específicos (Di Stefano et al., 2003). O parceiro de heterodimerização DP não parece determinar a especificidade de ligação dos factores E2F para as proteínas de bolso. Contudo, os factores DP funcionam na estabilização da interacção entre os factores E2F e as proteínas Rb (Helin et al., 1993).
Durante a resposta de proliferação celular, existe uma expressão diferente dos vários E2F, apresentando um aumento de E2F3 no início de G1 a meados de G1 e com E2F1 e E2F2 a aumentar na fronteira G1/S (Johnson et al., 1998). E2F4 e E2F5 são expressos ao longo de todo o ciclo celular, mas em G0 e G1 inicial, são ligados ao núcleo por p107 e Rb2/p130, formando complexos repressores transcripcionais. p107 e Rb2/p130 recrutam E2F4 nos núcleos da célula, induzindo a repressão da transcrição dos genes da fase S e a proliferação celular. Entretanto, acredita-se que pRb liga E2F1-3 ou a promotores que respondem a E2F (De La Luna et al., 1996).
Após estimulação, as células quiescentes entram no ciclo celular, e na fase G1 inicial, pRb é fosforilado e consequentemente os factores transcripcionais de E2F1-3 são libertados, enquanto que apenas em meados de G1 a G1 tardia, podemos observar a perda de complexos Rb2/p130. Portanto, na fase G1 tardia, as proteínas Rb são fosforiladas e dissociam de E2Fs; E2F4 e E2F5 passam para o citoplasma e E2F1-3 ligam-se aos promotores que respondem a E2F em sítios que muitas vezes são diferentes do sítio de ligação das proteínas repressoras de E2F (Cinti et al., 2000). Na transição da fase G1/S, complexos contendo p107 em associação com E2F4 ainda podem ser detectados (Mudryj, 1991). Estes complexos E2F4-p107 também contêm ciclina E ou A e cdk2 (Shirodkar, 1992). Foi também demonstrado que os complexos E2F-p130 se acumulam, uma vez que alguns tipos de células, incluindo miooblastos e melanócitos, sofrem uma diferenciação terminal (Shin et al., 1995).
pRb e as proteínas relacionadas p107 e Rb2/p130 não têm uma função totalmente redundante na regulação da transcrição dos genes E2F; em vez disso, mostram uma grande redundância ao nível do ciclo celular. Por exemplo, em pRb-/- fibroblastos, há um aumento compensatório nos níveis de proteína p107 durante a paragem na fase G0/G1 (Sage et al., 2003). O mecanismo deste efeito antiproliferativo de p107 é desconhecido – p107 poderia substituir pRb na regulação de E2F1-3 ou pode reprimir alguns genes que são controlados por pRb (Lee et al., 2002). Além disso, pRb também pode ligar E2F4 in vitro mas não consegue regular o promotor de E2F-responsivo em células p107-/- e p130-/-. Foi demonstrado que o complexo pRb-E2F4, em células p107-/-, não consegue ligar os mesmos sítios promotores que são normalmente ligados pelo complexo p107-E2F4 em células do tipo selvagem (Rayman et al., 2002).
No entanto, pRb está envolvido na repressão de um conjunto limitado de genes E2F em células G0 e G1, e recentemente foi definido o seu papel na repressão do gene ciclina E. O promotor da ciclina E está de facto desregulado em células que perderam pRb, embora o complexo p107/p130-E2F4 ainda esteja disponível (Herrera et al., 1996). pRb medeia a repressão do promotor da ciclina E através do recrutamento de HDAC e histona metiltransferase num sítio específico de E2F-SP1 que está exclusivamente ligado pelos complexos pRb-E2F1-3. A ciclina E é desreprimida não só pela perda de pRb mas também pela perda de proteínas E2F1-3, pelo que é evidente que as proteínas E2F1-3 actuam neste caso como repressores em vez de activadores (Wu et al.., 2001). p107 ou Rb2/p130 só podem substituir pRb se estiverem presentes em quantidade suficiente para ligar proteínas E2F1-3 (Lee et al., 2002).
pRb podem inibir a proliferação através de um mecanismo independente de E2F. Por exemplo, pRb pode induzir a formação de corpos nucleares de leucemia promielocítica (PML) (Fang et al., 2002), aumentar a expressão p27 (ver acima), suprimir a sinalização de Ras (Lee et al., 2002).
p>pRb pode inibir a proliferação através de um mecanismo independente de E2F, 2002) e cooperar com hLin-9, uma proteína que está envolvida, semelhante à pRb, na supressão da transformação mas de forma independente de E2F (Gagrica et al., 2004).
RB/E2F complexos repressores também podem ser regulados de forma independente de Cdk. Por exemplo, o factor de crescimento transformador-β recruta E2F4/p107 e E2F5/p107 pelo promotor c-myc independentemente da fase celular, e ainda é estável na presença de alta actividade de Cdk (Chen et al., 2004). Nas células humanas, notou-se que os p107 e p130 são removidos dos promotores de genes regulados pelo ciclo celular durante a fase S, mas ainda estão localizados nos promotores dos genes apoptóticos (Young et al., 2004). A regulação do complexo RB/E2F de uma forma independente de Cdk- ainda não é bem compreendida.
Ligação a proteínas que modificam a estrutura cromatina
Repressão pelas proteínas Rb requer os domínios conservados A e B da proteína de bolso e parece envolver a associação de outras proteínas para além dos factores E2F. As proteínas Rb reprimem a transcrição através da remodelação da estrutura da cromatina através da interacção com proteínas como hBRM, BRG1, HDAC1 e SUV39H1 (Shao et al., 1995), que estão respectivamente envolvidas na remodelação de nucleossomas, na acetilação/desactilação histórica e na metilação.
hBRM e BRG1 são homólogos mamíferos de componentes do complexo de remodelação de cromatina de levedura SNF2/SWI2 (Strober et al., 1996). Tanto o BRG1 como o hBRM demonstraram estar associados ao pRB e estão implicados na repressão mediada pelo pRb. Uma interacção física entre pRb e BRG1 não é necessária para a paragem do crescimento induzida por pRB e a repressão transcripcional dos genes alvo de E2F (Kang et al., 2004).
Histone deacetylase 1 é um HDAC que demonstrou recentemente ter sido recrutado para complexos E2F por pRb e funcionar na repressão da expressão do gene ciclina E (Magnaghi-Jaulin et al., 1998). Os histones são geralmente hiperacetilados nos promotores de genes transcritos activamente, mas são hipoacetilados em genes silenciados. A deacetylase de Histone é geralmente recrutada em promotores de genes por muitos reguladores transcripcionais. pRB associa-se à actividade HDAC in vivo e liga-se aos HDACs de classe I (HDAC1-HDAC3) in vitro. A repressão mediada pela pRB é reforçada pelo HDAC1 em experiências de transfecção transitórias, e para confirmar esta associação entre pRb e HDAC, foi demonstrado que a inibição da actividade do HDAC com trichostatina A interfere com a repressão mediada pela pRB num subconjunto de promotores regulados por E2F (Zhang et al.., 2000). O Histone deacetylase está assim envolvido na modulação da actividade repressiva da pRb nos promotores do gene E2F. O recrutamento da HDAC pode ser indirecto e acompanhado pelo recrutamento de outras proteínas de ligação, tais como a RBP1, os principais compressores e as proteínas remodeladoras de cromatina (Lai et al., 1999). Rayman et al. (2002) demonstraram que nas células Rb-/-, o HDAC está nos promotores genéticos E2F; isto permitiu-nos colocar a hipótese de que a pRb não é estritamente necessária na repressão transcripcional de E2F, mas que outros mecanismos poderiam estar envolvidos. As proteínas de histona acetiltransferase (CCBP, p300, Tip6, etc.) participam na activação das proteínas E2F (Condorelli e Giordano, 1997); interagem com o domínio de activação das proteínas E2F e estimulam a sua activação.
SUV39H1 é uma metiltransferase que especificamente metilatos K9 de histona H3 e coopera com pRb na repressão do promotor dos genes que respondem a E2F. Em células sem pRB, não há associação de me-K9-H3 nestes promotores (Rea et al., 2000); em particular, estes resultados foram desenvolvidos através do estudo da ciclina E, um dos melhores genes-alvo E2F modulados por pRb. Tanto pRb como SUV39H1 estão directamente envolvidos na repressão da transcrição da ciclina E, uma vez que tanto em pRb-/- como em SUV39H1-/- células de dupla knockout, a ciclina E é sobreexpressa. As proteínas Rb são também capazes de impedir a montagem de complexos de pré-iniciação, inibindo a actividade dos factores de transcrição recrutados nos promotores de genes E2F (Ross et al., 1999).
O tipo de repressão que as proteínas Rb exercem sobre o crescimento celular depende do tipo de proteínas do núcleopressor que ligam os genes alvo E2F. Por exemplo, diferentes tipos de repressão transcripcional podem operar no mesmo promotor num estado celular diferente ou num fenótipo celular diferente (Dimova e Dyson, 2005).
O complexo pRb/E2F também pode promover uma repressão estável independentemente da posição do ciclo celular ou por ser resistente à progressão do ciclo celular. Infelizmente, os mecanismos pelos quais o pRb está envolvido em processos que reprimem permanentemente a transcrição dependente de E2F não são até agora bem conhecidos. Por exemplo, o E2F4 pode ser encontrado em promotores regulados por E2F na fase S, mas não é claro se actua como activador. As células senescentes, por exemplo, mostram um nível mais elevado de metilação H3K9 em promotores que respondem a E2F em comparação com células quiescentes (Narita et al., 2003). As proteínas Rb mediam genes E2F-responsivos tanto em estado quiescente como senescente/diferenciado, sendo as primeiras caracterizadas por níveis baixos de metilação H3K9, e as últimas por níveis elevados de metilação H3K9. A identidade da histona metiltransferase que é recrutada no promotor pode também modular a transição entre uma célula quiescente e uma célula senescente/diferenciada.