Material vegetal, condições de cultura e tratamentos radiculares
Medago truncatula-R108 de tipo selvagem, utilizadas para este estudo, foram colhidas em 2008 no INRA-Montpellier, França, e conservadas a – 20 °C num tubo em que o espaço vazio foi preenchido com algodão hidrófilo para reduzir a humidade. As sementes foram ligeiramente escarificadas utilizando papel de areia (grão P80) e depois esterilizadas à superfície 30 min sob agitação numa solução preparada dissolvendo 1/4 de uma pastilha de lixívia comercial em 250 mL de água suplementada com 30 µL de detergente. Sementes em que depois foram cuidadosamente lavadas três vezes em água esterilizada sob um fluxo laminar. Se o detergente ainda estivesse presente, foram realizadas etapas de lavagem adicionais. Após a última lavagem, as sementes foram mantidas 1 h em água à temperatura ambiente para a imbibição. O excesso de água foi removido e as sementes foram espalhadas aleatoriamente em água média 1% ágar (HP 696-Kalys). As placas foram posicionadas de cabeça para baixo a 4 °C no escuro durante 3 a 4 dias de estratificação. Finalmente, a germinação foi alcançada à temperatura ambiente no escuro durante a noite, mantendo as placas de cabeça para baixo para permitir um crescimento de raízes rectas fora do ágar, e para facilitar uma maior transferência num novo meio de cultura. As plântulas foram então cultivadas em meio Fahraeus modificado solidificado com 1,3% de ágar (HP 696-Kalys) (meio Fahraeus modificado): CaCl2 1 mM, MgSO4 0,5 mM, KH2PO4 0,7 mM, Na2HPO4 0,8 mM, Fe EDTA 50 μM, 0,1 mg/L de cada um dos seguintes microelementos: MnSO4, CuSO4, ZnSO4, H3BO3 e Na2MoO4, pH ajustado a 7,5 com KOH) . Um máximo de 8 plântulas com raízes de cerca de 1 cm foram transferidas por placa de Petri quadrada (12 cm × 12 cm) contendo o meio de cultura coberto por um papel absorvente inerte (Mega International-USA) para evitar a penetração das raízes. Durante a transferência, foram adicionados 125 µL de água Milli-Q estéril a cada raiz para evitar a secura antes de fechar as caixas com fita adesiva Millipore. Foram utilizados bolsos pretos para cobrir a parte inferior do prato, a fim de proteger as raízes da luz. Finalmente, os pratos foram posicionados com um ângulo de cerca de 45° da vertical em salas de cultura mantendo condições a 24 °C, 60% de humidade e 16 h de iluminação.
Para testar o algoritmo RHS, as raízes foram submetidas a diferentes tratamentos. Um primeiro conjunto de plantas não tratadas foi cultivado durante 3 dias após a transferência, antes de se obterem imagens das suas raízes sob um microscópio. Para condições de tratamento, 2 dias após a transferência, foram abertos e colocados pratos na horizontal para adicionar 20 mL de soluções de tratamento compostas de 10 nM factor de Nod (NF), ou 10 µM ácido Indole-3-acetico (IAA) diluído em água Milli-Q estéril. Como controlo, as plantas foram tratadas com Milli-Q estéril. Após 1 h de imersão radicular, o excesso de líquido foi removido, e os pratos foram fechados e colocados de novo na sala de cultura durante 18 h.
Arabidopsis thaliana (Col0) sementes foram esterilizadas à superfície durante 3 h com gás cloro produzido misturando 3 mL de HCl 37% com 50 mL de hipoclorito de sódio 10%. As sementes foram espalhadas num prato quadrado (12 cm × 12 cm) preenchidas com 1/2MS de gelificado médio usando 0,8% de ágar vegetal (Duchefa). O prato foi armazenado durante 2 dias no escuro a 4 °C para estratificação e depois a 21 °C, 16 h de iluminação para germinação e cultura. Após 9 dias, as plântulas foram utilizadas para aquisição de imagem.
Brachypodium distachyon (Bd21-3) as sementes foram descascadas a partir da casca utilizando fórceps, depois esterilizadas durante 15 min num balancim em 1 mL de tampão de esterilização (20% de lixívia doméstica, 0,1% de Tween20) e lavadas 4 vezes em água bidestilada. As sementes foram depositadas num prato quadrado (12 cm × 12 cm) preenchido com 1/2MS complementado com 1% de ágar, com o pólo embrionário do longo eixo da semente a apontar para baixo. Após 2 dias de estratificação a 4 °C, os pratos foram transferidos e colocados verticalmente numa câmara de crescimento a 28 °C e 16 h de iluminação para germinação. As plântulas estavam prontas para a imagiologia 3 dias após a germinação.
Image acquisition
antes de descrever em detalhe as diferentes etapas do método, todo o pipeline representando todo o processo que engloba a imagiologia, a análise Fiji Script, a classificação dos dados e o ajuste sigmóide está resumido no ficheiro adicional 2: Figura S6.
Três dias após a transferência para a câmara de crescimento (ou seja, 18 h após tratamentos específicos, se aplicável), as raízes foram excisadas dos órgãos aéreos e colocadas entre a lâmina e a lamela em meio líquido Fahareus. Foi utilizado um microscópio de campo brilhante (Leica DMI6000 com estágio motorizado x, y, z. Software LAS, lâmpada de halogéneo Leica, 5× objectiva seca com abertura numérica 0,15, Câmara Hamamatsu Orca ER-1395) para adquirir imagens com uma resolução de 19,703 ppi. A largura RH é em média coberta por 10 pixels. A fase motorizada do microscópio e as instalações de reconstituição do mosaico do software LAS foram utilizadas para adquirir e reconstituir todas as imagens analisadas (ferramentas análogas estão disponíveis gratuitamente em ImageJ e Fiji ). A selecção precisa do fim da zona de raiz a adquirir não é necessária, uma vez que esta selecção será padronizada mais tarde com o modelo sigmoidal. Para obter imagens nítidas de RHs ao longo da raiz, foram adquiridas pilhas-Z de cinco imagens espaçadas por 100 µm.
Brightfield images of Arabidopsis roots were obtained with a resolution of 15,631 ppi by placing the open culture box directly under a Nikon SMZ18 stereoscope, equipped with a 0.5× Nikon SHR Plan Apo WD:71 objective, zoom 8, and Hamamatsu C11440 camera. Foram adquiridas três posições XY por raiz, movendo manualmente a caixa sob o campo de visão de modo a que duas imagens consecutivas se sobrepusessem. Não foi necessária nenhuma pilha Z.
Brachypodium seedlings foram imergidos entre as lâminas de microscópio e as lamelas de cobertura cheias de água, mantendo as folhas descobertas das lamelas de cobertura. As imagens foram adquiridas com o mesmo sistema óptico que para as plântulas de Arabidopsis, com uma ampliação final de 40×. Foram adquiridas duas posições XY por raiz, a fim de ter 2 imagens consecutivas sobrepostas. Não foi necessária a utilização de Z-stack.
XY imagens obtidas para Arabidopsis e Brachypodium foram cosidas em Fiji utilizando o plugin 2D Stitching . Se a sobreposição de imagens não foi suficiente para que o pesponto 2D funcionasse correctamente, o pesponto foi executado manualmente usando o plugin MosaicJ .
Root Hair Sizer: image processing
Todo o processamento de imagens foi feito usando o software de código aberto de Fiji, mas também pode ser conseguido no software de código aberto ImageJ com os plugins AnalyzeSkeleton e Auto_Threshold instalados . Como ponto de partida, é necessária uma única imagem onde todos os RHs são focalizados. Aqui, gerámos projecções Z somando cinco fatias adquiridas, mas qualquer método de aquisição e processamento produzindo uma única imagem nítida de RHs ao longo da raiz pode ser utilizado.
O resto do processamento pode ser aplicado executando o algoritmo RHS disponível no ficheiro adicional 1: Script 1. Um resumo de todos os passos do algoritmo está também disponível na Tabela 1 e ilustrado nas Figs. 2 e no ficheiro Adicional 2: Fig. S5. O ficheiro Adicional 5: Filme 1 está adicionalmente disponível para clarificar a compreensão da interface. A primeira parte do processamento do RHS consiste na detecção da área de RHs. O método, inspirado em Inoue et al. , consiste em limiares de intensidade de píxeis. Um primeiro processo detectará o contorno de RHs, enquanto que um segundo processa apenas o contorno da raiz. Para evitar a definição manual do limiar de intensidade de píxeis, foi utilizado um limiar automatizado. A detecção da raiz com RHs foi obtida utilizando o método de Bernsen, enquanto o eixo da raiz foi detectado apenas pelo método Phansalkar (Ficheiro adicional 2: Fig. S7 e Tabela 1-passos 3 e 4) . Para suavizar e preencher furos de ambas as imagens binárias geradas, foram aplicadas várias etapas de dilatação de pixels e erosão (Tabela 1-passos 3.2 e 4.2). A imagem do eixo raiz foi então subtraída de toda a imagem raiz (raiz com RHs) (Ficheiro adicional 2: Fig. S7 e Quadro 1, passo 5) para obter a superfície coberta apenas por RHs. O ruído de fundo foi apagado no passo 5.2 (Tabela 1-step 5.2).
As etapas subsequentes requerem que a raiz seja direita, a linha média da raiz (RML) é recuperada como o caminho mais longo do esqueleto obtido a partir da imagem do eixo da raiz depois de executar os comandos ‘Esqueletizar’ e ‘Analisar Esqueleto (2D/3D)’ (Ficheiro adicional 2: Fig. S7 e Tabela 1-step 8.1 e 8.2). A imagem RML é então convertida numa selecção polit-linear (passos 8.3 e 8.4), e endireitada com o comando Fiji ‘Straighten’ (Ficheiro adicional 2: Fig. S7 e Tabela 1 passo 10). Uma vez que ‘Endireitar’ gera uma imagem de níveis cinzentos, é implementada uma binarização adicional (Tabela 1-passos 11 e 12). Na imagem final, os pixels RH têm um valor de 1, e os pixels de fundo um valor de 0,
Root Hair Sizer: A medição do comprimento de RH
Medição do comprimento do cabelo em duas etapas, conforme detalhado na secção “Resultados” (Fig. 2). Primeiro, uma selecção rectangular é deslizada ao longo do eixo da raiz da imagem alisada e binarizada de RH, medindo a altura “L” da superfície de RH dentro da selecção em cada passo (Tabela 1-passos 14.1 a 14.3) com a fórmula (1). Segundo, um dado número (tipicamente 10) de valores L individuais consecutivos foram Max-filtrados para obter um valor Lmax como uma estimativa do comprimento de RH (Tabela 1-passos 14,4 a 14,5). Cada valor Lmax está associado a uma distância correspondente da ponta da raiz e escrito numa tabela.
Root Hair Sizer: ajustes ajustáveis
Dependente do tipo de raiz e propriedades da imagem adquirida, pode ser necessário ajustar alguns ajustes. Os passos ajustáveis são realçados com vários asteriscos no script RHS, enquanto os ajustes que empregamos nos exemplos mostrados em Medicago são listados na Tabela 1. Ao fazer o limiar da imagem, o valor do raio para os métodos de limiar de Bernsen e Phansalkar pode ser adaptado, por exemplo, para imagens de resolução diferente, bem como o número de erosões e dilatações aplicadas imediatamente a seguir. Se o perfil do pêlo radicular e o tipo de aparelho óptico utilizado para a aquisição forem muito diferentes do exemplo aqui apresentado, os utilizadores são encorajados a personalizar a estratégia de limiar para se adaptarem às suas próprias definições. Para as raízes Arabidopsis, por exemplo, no passo 3 foi utilizado o método de limiar Phansalkar em vez de Bernsen para detectar a forma de RH, enquanto que no passo 4 foi utilizado o método de limiar Bernsen em vez de Phansalkar para detectar a forma da raiz. Além disso, o passo 5 já não era necessário (Ficheiro adicional 4: Roteiro 4). O processo de esqueletização da raiz pode também necessitar de alguns ajustes. A quantidade de simplificação da linha poligonal destacando a linha média da raiz obtida após os comandos ‘Skeletonize’ e ‘Analyse Skeleton (2D/3D)’ pode ser ajustada para imagens muito maiores ou menores. Finalmente, no processo de endireitamento, é importante ajustar a largura da poliglinha de modo a cobrir todas as RHs.
Ao executar RHS, uma caixa de diálogo permite ao utilizador seleccionar o segmento de raiz a analisar. A largura w da selecção de varrimento pode ser ajustada para que seja ligeiramente mais fina do que uma RH (de 1/2 a 2/3). Finalmente, o tamanho do intervalo em que Lmax deve ser escolhido também pode ser adaptado. Um intervalo de 10 selecções para recolher Lmax pareceu-me exacto nos exemplos aqui apresentados. O efeito da variação deste parâmetro, que regula a quantidade de pontos de dados retidos versus a variabilidade dos dados devido a, por exemplo, “buracos” no perfil de RH, é ilustrado no ficheiro adicional 2: Fig. S8).
Root Hair Sizer também propõe anotar a imagem se algumas partes da raiz precisarem de ser removidas da análise. A posição destes comentários ao longo da raiz é recuperada na tabela final através da anotação de cada ponto de dados como 1 e 0 (respectivamente a presença e ausência do comentário neste ponto) em colunas separadas. Além disso, em várias etapas, o RHS permite ao utilizador verificar e eventualmente corrigir manualmente o processo automático alcançado pelo algoritmo. Todas as definições automáticas e correcções manuais são registadas e guardadas como região de interesse (ROI). Após executar o RHS uma primeira vez, é possível analisar outra região da raiz enquanto se utiliza o ROI associado à imagem original, empregando o script apresentado no ficheiro adicional 6: Script 2. Para executar este script, é importante utilizar a mesma largura RML e preencher a primeira caixa de diálogo com os mesmos nomes de comentários utilizados com o algoritmo principal do RHS.
Processamento de dados
Os dados recolhidos com RHS são ordenados com software de folha de cálculo Excel. Para todos os resultados apresentados, as regiões que apresentavam um artefacto (por exemplo, uma bolha ou pó) foram removidas da análise. Para algumas imagens, um lado da raiz apresentou RH mais pequeno ao longo de todo o comprimento em comparação com o outro lado, principalmente para raízes que crescem lado a lado. Nestes casos, apenas o lado com HR mais longo foi mantido para a análise. Outras ordenações ou parâmetros específicos de dados são mencionados em legendas de figuras ou no texto. Como descrito acima em “Resultados”, a fim de encaixar com precisão os pontos de dados, procedemos com dois encaixes sigmóides sucessivos. Depois, como exemplo nas Figuras Fig. 3b, Ficheiro adicional 2: Figs. S3, S4, obtivemos uma boa estimativa da secção da curva que alberga uma forma sigmóide.
Os dados foram ajustados com a curva sigmóide \(f\ esquerda( d \ direita)\)
Este primeiro ajuste fornece o ponto de inflexão d50_1 e o comprimento da extensão δ_1. Depois, estabelecemos os limites para o segundo ajuste entre d50_1 ± 5δ_1.
Ajustamento sigmoidal foi conseguido utilizando o software GraphPad Prism. Os dados obtidos de cada imagem foram tratados separadamente. Foi aplicado um ajuste de mínimos quadrados utilizando as seguintes regras para definir os valores iniciais do ajuste para cada imagem considerada:
com Labsolute min e Labsolute max respectivamente o comprimento mínimo e máximo de RH medido em todos os dados obtidos ao longo de toda a raiz da imagem considerada.
Medição da taxa de crescimento da raiz
Esta medição foi feita em lotes separados de raízes na mesma condição do que para a medição do comprimento de RH. Após 1 h de imersão da raiz na solução de tratamento, as caixas foram esvaziadas, depois fechadas, e a posição RT foi marcada na tampa da caixa com um marcador. Após 18 h de incubação, a nova posição de RT foi marcada e a caixa foi digitalizada. A distância entre dois pontos consecutivos foi então medida utilizando o software de Fiji. A taxa de crescimento da raiz pode ser medida como a razão desta distância pelo tempo entre as duas medidas. O crescimento radicular foi medido a partir de duas réplicas biológicas dando os seguintes valores (média ± SE): sem tratamento: 296 ± 17 µm/h (n = 26); H2O: 304 ± 16 µm/h (n = 26); NF: 225 ± 15 µm/h (n = 23); IAA: 55 ± 3 µm/h (n = 19).
Statistics
GraphPad Prism software foi utilizado para obter análise estatística e ajuste sigmoidal. Todos os detalhes sobre o tamanho da amostra, réplicas biológicas ou testes com chumbo são especificados nas legendas das figuras.