Abstract
Fundo. Anteriormente, encontrámos mulheres com anticorpos anticentrómeros positivos que demonstravam potencial de maturação de oócitos e clivagem embrionária; o possível mecanismo por detrás deste fenómeno era ainda desconhecido. Objectivo. Assim, o presente estudo visava explorar preliminarmente se o ACA poderia penetrar nos embriões vivos e prejudicar o seu potencial de desenvolvimento através da cocultura in vitro com embriões de rato. Métodos. Os embriões de rato foram recolhidos e utilizados para cultura in vitro com anticorpos anticentrómeros policlonais da proteína A (CENP-A); depois, foi realizado um ensaio de imunofluorescência para determinar a penetração de anticorpos em embriões, e foi observado o potencial de desenvolvimento embrionário. Resultados. Todos os embriões cultivados com anticorpos anti-CENP-A exibiram imunofluorescência no núcleo, enquanto que nenhum dos embriões dos grupos de controlo exibiu imunofluorescência. Além disso, os embriões cultivados com anticorpo anti-CENP-A apresentavam uma deficiência significativa de crescimento em comparação com os controlos. Conclusão. Os embriões de rato podem ser um alvo directo para a ACA in vitro antes da implantação. Contudo, o mecanismo preciso necessita de mais esclarecimentos.
1. Introdução
Um estudo recente revelou perturbações da maturação dos oócitos e do desenvolvimento embrionário precoce em mulheres com anticorpos anticentrómeros positivos (ACA) no seu sangue periférico . Mais recentemente, descobrimos que as mulheres positivas para ACA tinham uma percentagem significativamente mais baixa de oócitos maduros e taxa de clivagem embrionária em comparação com as mulheres negativas para ACA , revelando ainda mais o potencial impacto da ACA na fertilidade feminina. Sabe-se que a ACA é um dos membros das ACA. Foi descoberta pela primeira vez em 1980 como um anticorpo específico contra o centromero no soro de pacientes com calcinose, fenómeno de Raynaud, dismotilidade do esófago, esclerodactilia, e síndrome de telangiectasia (CREST) . Agora, a ACA foi reconhecida como um marcador de diagnóstico auxiliar eficaz para a esclerose sistémica (SSc). Como foi relatado, as pacientes do sexo feminino com SSc são susceptíveis de ter vários resultados de gravidez adversos diferentes, incluindo aumento da taxa de aborto espontâneo, nascimento prematuro, bebés pequenos, e infertilidade . Adicionalmente, a prevalência da infertilidade em pacientes com SSc é elevada, e a taxa de sucesso no tratamento da infertilidade é relativamente baixa, o que necessita de mais investigação .
No início dos anos 90, os investigadores tentaram microinjectar ACA em ovos de rato, o que levou a perturbações do movimento cromossómico e da segregação . Sabe-se que o cinétocole é o local de fixação dos microtubos de fusos na região centromérica de um cromossoma . É também a estrutura dinâmica para mitose, meiose e outras actividades importantes das células . Portanto, seria razoável inferir que a ACA poderia interferir com a meiose ou mitose em células vivas.
Centromere é um complexo proteína de ADN, e a sua montagem é coregulada por cromatinas centrómicas e o seu complexo proteico associado . A proteína centrómero A (CENP-A) é uma das proteínas constituintes do centrómero com funções biológicas relativamente claras que tem sido estudada na sua maioria; o seu importante papel na montagem e implementação funcional do centrómero tem sido repetidamente verificado . Além disso, semelhante ao CENP-B, o CENP-A é considerado como um importante antigénio alvo da ACA .
Especulou-se que a ACA poderia ser um dos ANAs mais estreitamente associados à maturação anormal dos oócitos e à clivagem embrionária. Portanto, o objectivo do presente estudo era explorar o potencial impacto do ACA em embriões em fase inicial através da cocultura in vitro com embriões de rato.
2. Materiais e Métodos
2.1. Embriões de ratos
Superovulação foi induzida em ratos de Rato ICR de raça superior por estimulação com gonadotrofina sérica de égua grávida (10 IU intraperitonealmente (p.i.)) e gonadotrofina coriónica humana (10 IU p.i. após 48 h) e acasalada com machos de ICR. Os ratos fêmeas foram mortos 24 h após o acasalamento. Os embriões em fase inicial foram recolhidos por dissecação afiada das trompas de Falópio e utilizados nas experiências. O Comité de Ética do Primeiro Hospital Filiado da Universidade de Sun Yat-Sen aprovou este estudo.
2.2. In Vitro Embryo Culture
Os embriões foram cultivados no meio de série de Quinn (Sage, EUA). Para o grupo de anticorpos, foi adicionado ao meio anticorpo policlonal de coelho ao rato CENP-A (albumina de soro bovino e produtos personalizados sem azida, da Abcam, Reino Unido). A concentração de anticorpos no meio foi de 35 μg/mL (modificado com base na literatura). Para o grupo de tampão fosfato salino (PBS) (servido como controlo), a solução de PBS (PBS comprimido, Millipore, Merck, Alemanha) com o mesmo volume que a solução de anticorpos foi adicionada ao meio. O grupo de controlo em branco compreendia o meio sem quaisquer aditivos.
2,3. Ensaio de imunofluorescência
No segundo e terceiro dias de cultura, foram colhidos três a cinco embriões de cada prato dos três grupos para o ensaio de imunofluorescência, para detectar se os sinais de anticorpos anti-CENP-A estavam presentes nos embriões após a cocultura. Os procedimentos para o ensaio de imunofluorescência foram os seguintes: Os embriões foram fixados em polioximetileno a 4% e depois permeados com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, EUA), seguido de selagem em soro de burro normal a 5% (Jackson Immunoresearch, EUA). Depois disso, os embriões foram incubados durante 1 h com 488-buracos com rótulo IgG (Invitrogen, UK, 1 : 1000 diluição), enxaguados, incubados com 1 μg /mL DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole, dihidrocloreto, Cell Signaling Technology, USA) durante 15 min, novamente enxaguados, e fixados num prato para posterior observação microscópica. A fim de descartar falsos positivos do grupo experimental, embriões do grupo de anticorpos foram incubados com PBS em vez de IgG (grupo de anticorpos para controlo) de burro com 488 etiquetas IgG (grupo de anticorpos para controlo).
2.4. Desenvolvimento de Embriões Coculturados (Ensaio de Embriotoxicidade)
A recolha e o cultivo dos embriões para este ensaio de embriotoxicidade foram os mesmos descritos anteriormente, excepto que os embriões permaneceram nos pratos durante todo o período de 3 dias. Os embriões de cada grupo foram examinados para determinar o seu estado de desenvolvimento no terceiro e quinto dias (o primeiro dia referia-se ao dia da colheita de oócitos). Foram registadas as seguintes fases de desenvolvimento: 6 a 8 etapas de células no terceiro dia, e blastocisto, mórula, 2 a 8 células, e atretismo no quinto dia.
2,5. Análise estatística
Análise estatística foi realizada utilizando SPSS 13 (SPSS, IL, EUA). Foi utilizado um teste de qui-quadrado e partição de testes de qui-quadrado para comparar dados qualitativos. Um valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo pelo teste do qui-quadrado entre os três grupos, e um valor inferior a 0,0167 foi utilizado para indicar a significância estatística na partição dos testes do qui-quadrado entre grupos.
3. Resultados
3,1. Imunofluorescência
Todos os embriões cultivados com anticorpos anti-CENP-A exibiam forte imunofluorescência nos seus núcleos, enquanto que nenhum dos embriões dos grupos PBS e controlo em branco, bem como o grupo de anticorpos para controlo, exibiam imunofluorescência (Figura 1).
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3.2. Ensaio de Embriotoxicidade
Comparado com os grupos de PBS e de controlo em branco, as percentagens de embriões da fase de 6 a 8 células no terceiro dia, bem como de embriões da fase de blástula e mórula no quinto dia, foram significativamente mais baixas no grupo de anticorpos. Os potenciais de desenvolvimento dos embriões eram comparáveis entre a PBS e os grupos de controlo em branco (Quadro 1).
| Parâmetros (%) | Grupo de corpo | Grupo de PBS | Grupo de controlo em branco | valor |
| 6- a 8 etapas de células no terceiro dia | 24.8% (114/459) | 48,4% (183/378) | 51,0% (192/376) | <0.01a,b |
| estágio da blástula no quinto dia | 26.8% (123/459) | |||
| 20,2% (76/376) | <0.01a,b | |||
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4. Discussão
Em 1999, os investigadores descobriram que todos os embriões de rato cultivados com IgG antinuclear purificada exibiam uma forte imunofluorescência sobre as células embrionárias e apresentavam um défice significativo de crescimento ou morte em comparação com aqueles cultivados com imunoglobulinas de controlo. Isto indicava que as ANAs podiam ligar-se directamente aos embriões in vitro. Contudo, os epitopos exactos não eram conhecidos porque não foram encontrados antígenos nucleares ou fosfolípidos na zona. Em embriões em fase de 2 células de rato, um conjunto de nucleoproteínas é sintetizado transitoriamente e alterações na composição da cromatina embrionária, sugerindo que os embriões iniciais podem possuir epitopos para ANA . Além disso, a ligação é relativamente específica, uma vez que os anticorpos anti-tiróides e os anticorpos de indivíduos saudáveis não mostram qualquer evidência de ligação aos embriões. A microinjecção de soro contendo ACA em oócitos de rato poderia impedir a congressão cromossómica e causar uma paragem meiótica na interfase ou uma paragem mitótica na prometafase .
No presente estudo, todos os embriões cultivados com anticorpos policlonais anti-CENP-A mostraram uma forte imunofluorescência de anticorpos contra componentes nucleares (que se especulou serem anticorpos anti-CENP-A) e sofreram uma aparente diminuição do crescimento embrionário, indicando que os embriões de rato podem ser um alvo directo para alguns ACAs in vitro antes da implantação. Além disso, para a maioria dos embriões coculturados, sempre apenas um ou alguns dos blastómeros mostraram fluorescência. Talvez, a densidade de estruturas dentro e à volta do centromero impede o acesso de anticorpos anti-CENP-A, ou o blastômero com fluorescência detectável estava inclinado a apoptose e apresentava estruturas relativamente soltas que permitiam o acesso de anticorpos anti-CENP-A. Contudo, o mecanismo preciso necessita de mais esclarecimentos.
Embora não exista um conceito definido para a entrada de anticorpos nas células vivas, e o mecanismo envolvido seja ainda desconhecido, estes estudos forneceram provas da entrada de anticorpos nas células vivas. Por exemplo, a antiribonucleoproteína-IgG podia entrar selectivamente nos linfócitos T, enquanto relativamente menos receptores Fc estavam presentes na superfície dos linfócitos T. Sugeriu que alguns outros mecanismos relevantes para a regulação não-Fc poderiam estar envolvidos, que poderiam estar associados a estruturas semelhantes a antigénios na superfície dos linfócitos, implicando que os anticorpos da ribonucleoproteína interagissem com os antigénios da ribonucleoproteína na superfície celular para regular o seu acesso às células vivas .
Este estudo também descobriu que o potencial de desenvolvimento embrionário foi significativamente prejudicado após cultura com anticorpos anti-CENP-A, exibindo percentagens significativamente mais baixas de embriões em fase de 6 a 8 células no terceiro dia e embriões em fase de blástula no quinto dia. De facto, um estudo anterior revelou que embriões de rato cultivados com IgG purificada a partir de soro ANA-positivo apresentavam um potencial de desenvolvimento embrionário significativamente prejudicado. O ANA poderia penetrar em estruturas subcelulares contendo antigénios correspondentes, onde poderia identificar e ligar-se a epitopos nas regiões funcionais importantes. Estes auto-anticorpos poderiam inibir significativamente a função dos antigénios tanto in vivo como in vitro .
Em conclusão, embriões cultivados com anticorpos anti-CENP-A sofreram uma deficiência significativa de crescimento ou morte. Assim, os embriões poderiam ser um alvo directo para o anticorpo anti-CENP-A.
Aprovação Ética
Comité de Ética Médica da Universidade de Sun Yat-sen, Primeira Afiliada, aprovou o estudo (nº 75).
Conflitos de Interesses
Ying Ying, Xi Guo, Yiping Zhong, e Canquan Zhou declaram que não têm conflito de interesses.
Conhecimentos
Este estudo foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (no. 81701518), Guangzhou Science and Technology and Information Bureau (no. 2014J4100161), Science & Technology Project of Guangdong Province (no. 2013B021800271), e Population and Family Planning Commission of Guangdong Province (no. 20132048). Este estudo foi apoiado pelo Key Laboratory for Reproductive Medicine da província de Guangdong do The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. O estudo foi também apoiado por dois laboratórios-chave do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou; foram eles o Laboratório Chave para as Principais Doenças Obstétricas da Província de Guangdong e o Laboratório Chave de Reprodução e Genética dos Institutos de Ensino Superior de Guangdong.