Western Blot (WB) é um método comum para detectar e analisar proteínas. É construído sobre uma técnica que envolve a transferência, também conhecida como blotting, de proteínas separadas por electroforese do gel para uma membrana onde podem ser visualizadas especificamente. O procedimento foi descrito pela primeira vez por H. Towbin et al em 1979 (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979) e dois anos mais tarde recebeu o seu nome por W. Neal Burnette (Burnette, 1981). Towbin et al descreveram a transferência electroforética de proteínas de géis de poliacrilamida para folhas de nitrocelulose, onde o padrão original do gel foi obtido com precisão. A configuração consiste num conjunto padrão de sete passos, Figura 1.
Figure 1. Os passos padrão em Western Blotting.
Amostras são preparadas e carregadas num gel e durante a electroforese as proteínas carregadas negativamente movem-se em direcção ao ânodo carregado positivamente. A fim de analisar melhor as proteínas, estas são transferidas para uma membrana num procedimento chamado blotting. Após a transferência, a membrana é bloqueada a fim de evitar a interacção indesejada membrana-proteína nas etapas seguintes. Para visualizar a proteína de interesse, a membrana é normalmente primeiro sondada utilizando um anticorpo primário específico da proteína, seguido de um anticorpo secundário rotulado utilizado para a detecção. É obtida uma imagem da membrana e o resultado é analisado.
Adicionando uma solução marcadora separada a um dos poços do gel, é possível estimar o tamanho da proteína, para além das interacções anticorpo que são utilizadas para verificar a proteína específica. A separação no gel não se deve apenas ao tamanho, mas também, em certa medida, dependendo da carga molecular, regiões hidrofóbicas, e grau de desnaturação. A configuração da experiência pode ser variada de muitas maneiras para melhor se adequar ao inquérito específico. Ao analisar os resultados, devem ser levadas em consideração as variações entre as faixas de carga e as taxas de transferência entre as manchas. Além disso, a relação não linear do sinal gerado em toda a gama de concentração das amostras é também um aspecto a ter em consideração ao interpretar os resultados. O resultado de uma experiência WB depende de três factores importantes; a capacidade do anticorpo de ligar uma proteína específica, a força da interacção, e a concentração da própria proteína de interesse. Além disso, a especificidade da ligação ao alvo e uma baixa reactividade cruzada são também características importantes. O resultado da WB nem sempre é fácil de interpretar, uma vez que o tamanho da proteína pode variar do peso teórico devido a modificações pós-tradução, tais como glicosilação, ou interacções com outras proteínas. Contudo, o WB é um método muito comum e quase todos os anticorpos comerciais disponíveis foram validados utilizando este método.
Tecnologia
Preparação da amostra
O primeiro passo de um WB é preparar a amostra, por exemplo tecido, células, ou outra solução, que vai ser analisada. Normalmente, o tecido precisa de ser decomposto por mistura, homogeneização, ou sonicação. Adicionam-se tampões para lisar as células e solubilizar as proteínas e muitas vezes adiciona-se um inibidor para evitar a desnaturação ou degradação. Diferentes tipos de métodos de filtração e centrifugação são aplicados para preparar ainda mais as amostras. É importante determinar a concentração total de proteínas do extracto gerado para poder carregar uma quantidade específica no gel para permitir a comparação entre as amostras. Normalmente é utilizado um ensaio bioquímico para determinar a concentração proteica. O extracto é então diluído com tampão de carga constituído por glicerol e um corante (por exemplo, azul de bromofenol). O glicerol é utilizado para simplificar a carga, aumentando a densidade do extracto e o corante é adicionado para visualizar a amostra. O calor é aplicado nas amostras a fim de quebrar as estruturas da proteína, o que ajudará a manter a carga negativa da neutralização (Mahmood & Yang, 2012). De preferência controlos positivos e negativos são incluídos no conjunto para confirmar a identidade da proteína, bem como a actividade do anticorpo.
Gel electroforese
Após a preparação da amostra, o extracto está pronto a ser carregado para separar as proteínas de acordo com o tamanho por electroforese em gel. Um campo eléctrico é aplicado sobre o gel que provoca o movimento das moléculas carregadas. Na WB os géis de poliacrilamida são utilizados para a separação de proteínas e o método é, portanto, chamado electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) quando se utiliza a condição nativa. Para condições de desnaturalização, o sulfato de sódio (SDS) é adicionado ao sistema e o método é portanto chamado SDS-PAGE. A SDS liga-se à proteína e forma uma micela de carga negativa em torno da proteína, independentemente da carga inerente. A condição de desnaturalização dissolve a estrutura tridimensional das proteínas e a carga da proteína torna-se relativa ao seu tamanho, resultando na separação das proteínas apenas pelo tamanho. Ao utilizar condições nativas a mobilidade depende tanto da carga como do tamanho hidrodinâmico permitindo a detecção de alterações na carga devido a degradação química, alterações conformacionais devido a dobragem ou desdobramento, agregação, ou outros eventos de ligação.
O gel consiste tipicamente em duas secções com densidades diferentes: (i) um gel empilhador, e (ii) um gel separador, Figura 2. As diferenças entre as duas secções estão no pH e na concentração do gel. Com um pH um pouco ácido e uma concentração mais baixa de acrilamida, o gel empilhador separa mal as proteínas, mas permite-lhes formar bandas afiadas altamente definidas antes de entrarem no gel separador. Com condições mais básicas e maior concentração de gel, o gel separador faz com que as proteínas se diferenciem pelo tamanho, uma vez que as proteínas mais pequenas viajam mais rapidamente no gel do que as maiores. Os géis pré-fabricados são convenientes; contudo, é possível lançá-los à mão. O gel é imerso em tampão e as amostras de proteínas e marcadores são carregados para os poços do gel. É aplicada uma tensão no gel e as proteínas começarão a descer pelo gel devido à sua carga eléctrica negativa. A selecção da voltagem adequada é importante uma vez que uma voltagem demasiado alta sobreaquecerá o gel e talvez deformará as bandas.
br>>>p>Figure 2. Um gel típico imerso em tampão.
Blotting à membrana
Após electroforese do gel, as proteínas são transferidas para uma membrana de suporte sólida, que é o terceiro passo do Western Blot. No processo de transferência, a tensão é aplicada para transferir as proteínas do gel para a membrana. A configuração inclui esponjas, papéis de filtro, o gel, e a membrana, que é colocada entre o gel e o eléctrodo positivo, Figura 3. Isto assegura a migração das proteínas de carga negativa do gel para a membrana. Existem três tipos de membranas: nitrocelulose, difluoreto de polivinilideno (PVDF), e nylon. Embora as membranas de nylon sejam superiores em vários aspectos, a alta ligação ao fundo e a coloração irreversível de alguns corantes torna este tipo de membrana menos comum do que as outras duas alternativas. A principal vantagem das membranas de nitrocelulose é o fundo baixo, independentemente do método de detecção. Devido a um tamanho médio de poros relativamente grande, as membranas de nitrocelulose não devem ser utilizadas para transferência de proteínas com baixo peso molecular. Além disso, quando secas, a membrana torna-se frágil, o que as torna difíceis de manusear. A membrana PVDF mais estável permite a re-rotulagem e é mais conveniente de armazenar. A natureza hidrofóbica do PVDF resulta numa elevada capacidade de ligação de proteínas, contudo, como consequência, o fundo é também mais elevado.
br>>>p>Figure 3. As proteínas no gel são embotadas numa membrana e a amostra é visualizada através de bloqueio, adição de anticorpos, e lavagem de acordo com um determinado horário.
Existem dois métodos para o blotting chamado wet e semi-dry. As condições húmidas são preferidas quando a transferência deve ser eficiente e dar alta qualidade em relação a bandas distintas e afiadas. Além disso, esta é a melhor escolha para a transferência de um complexo proteico maior. O gel, membrana, e papéis filtrantes são completamente imersos em tampão durante a transferência e não há risco de secar o gel. A blotting semi-seca é mais rápida e é necessário menos volume de tampão. Contudo, este método de transferência é normalmente menos eficiente, especialmente para proteínas maiores, e existe o risco de sobreaquecimento e secagem do gel quando se utilizam tempos de transferência prolongados.
Sondagem de anticorpos
O quarto passo do WB é a sondagem de anticorpos. A fim de evitar a ligação não específica dos anticorpos à membrana, em vez da ligação específica à proteína de interesse, é utilizada uma substância para bloquear os locais residuais na membrana. As substâncias comuns utilizadas são leite não gordo seco, albumina de soro bovino (BSA) a 5% diluída em Tris Buffered Saline Tween (TBST), soro normal de cabra, caseína, ou gelatina de peixe (Mahmood & Yang, 2012). O leite é fácil de obter e barato, mas não é adequado para todos os rótulos de detecção. A gelatina de peixe dá um fundo mais baixo, mas pode mascarar algumas proteínas, além de ser um tampão de bloqueio relativamente caro. A BSA é barata, enquanto que o soro pode conter imunoglobulinas que dão origem a reactividade cruzada. A selecção cuidadosa do agente de bloqueio é fundamental, uma vez que nenhum dos tampões de bloqueio é ideal para todas as diferentes interacções antigénio-anticorpo. O procedimento de bloqueio consiste em incubar a membrana no tampão de bloqueio adequado durante uma hora ou mais. Ao utilizar tempos de incubação longos, o bloqueio deve ser efectuado a +4°C para excluir o risco de coloração de artefactos ou de fundo. O bloqueio é um equilíbrio delicado entre a redução do fundo sem diminuir o sinal da proteína de interesse.
A membrana bloqueada é depois incubada com o anticorpo primário. O anticorpo é diluído a uma concentração adequada em TBST, tampão fosfato salino (PBS), ou tampão de lavagem. É preferível incubar o anticorpo com BSA se o anticorpo vai ser reutilizado. Após lavagem da membrana, a membrana é incubada com o anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário. O anticorpo secundário é rotulado com um repórter. Quando se utiliza um anticorpo policlonal como anticorpo secundário, este pode dar origem a algum fundo. No caso de coloração de fundo, o anticorpo secundário pode ser pré-bloqueado com soro não imune do hospedeiro em que foi gerado. A optimização da concentração do anticorpo secundário é recomendada devido a variações bastante extensas entre os anticorpos, bem como ao sistema de detecção utilizado.
Detecção
No quinto passo de um WB, o complexo proteína-anticorpo-anti-corpo é detectado na membrana. Existem vários tipos de rotulagem do anticorpo secundário, por exemplo, enzimas, fluoróforos, biotinilação, conjugação de ouro, e radioisótopos, como exemplificado na Figura 4. Entre as enzimas, a mais comum é a HRP usada juntamente com substâncias quimioluminescentes, quimifluorescentes, ou cromogénicas. O HRP tem uma elevada especificidade de substrato, dando um baixo fundo, é estável, e barato. Na quimioluminescência, a enzima HRP catalisa a oxidação do luminol do reagente de detecção de peróxido de luminol. A reacção em múltiplas etapas gera emissão de luz. Alguns produtos químicos como os fenóis podem melhorar a luz emitida. Um método directo é a utilização de fluorescência; os fluoróforos emitem luz após serem excitados e não é necessário nenhum agente de detecção. É bem adequado para o Ocidente quantitativo e uma vez que diferentes fluoróforos emitem luz de diferentes comprimentos de onda, é possível efectuar a multiplexação e detecção específica de mais do que uma proteína de cada vez. A utilização de uma substância química e/ou enzima para induzir a geração de um fluoróforo activo a partir de um substrato fluorogénico chama-se quimifluorescência. Para aumentar ainda mais a intensidade do sinal, pode ser utilizado um sistema baseado na estreptavidina biotínica em duas etapas. A conjugação do ouro é também um método em que as proteínas mancham de vermelho escuro devido à acumulação de ouro. Também é possível utilizar radioisótopos mas estes requerem um manuseamento especial e são bastante caros.
br>>>p>p>Figure 4. Diferentes sistemas de repórter.
Imaging
Imaging é o sexto passo do WB e a captura pode ser analógica usando um filme, ou digital com uma câmara CCD ou scanner capturando os diferentes tipos de sinais emitidos. O dispositivo de imagem CCD permite a quantificação com alta sensibilidade de detecção e uma ampla gama linear sem desperdício químico ou necessidade de uma sala escura. Pode ser utilizado para detectar membranas, géis corados, ou para aplicações de luz ultravioleta.
Análise
O último passo de um WB é analisar os resultados. Numa aplicação qualitativa típica, a presença de uma proteína de interesse é confirmada, a quantidade é aproximada por inspecção visual, e o tamanho é determinado por comparação com um marcador. Melhorias e desenvolvimentos, especialmente no sentido de reagentes de detecção altamente sensíveis e técnicas de imagem avançadas, fazem da WB uma ferramenta potencial para a análise quantitativa. As aplicações quantitativas implicam uma definição da quantidade de proteína em termos relativos ou absolutos. Alguns factores devem ser tomados em consideração como a sensibilidade, a estabilidade do sinal, a amplitude dinâmica linear, a normalização e a relação sinal/ruído. O mínimo de proteína que pode ser visto num determinado ensaio dá os limites de detecção (LOD), e o limite de intensidade do sinal que pode ser usado com fiabilidade para uma quantificação precisa é o limite de quantificação (LOQ). Os factores que afectam estes termos são a qualidade e concentrações de anticorpos, bem como os tempos de exposição, quando se considera a quantidade mínima de proteína detectada. Um sistema de sinal estável expande a janela temporal para atingir uma alta sensibilidade, múltiplas exposições, e possibilidade de detectar bandas fracas. A gama que permite uma quantificação uniforme e precisa onde a intensidade do sinal ainda é proporcional à quantidade de proteína é chamada de gama dinâmica linear. É importante evitar a saturação do sinal devido a quantidades excessivas de proteína ou concentrações elevadas de anticorpos. Uma baixa LOD e a quantificação de sinais fracos e fortes dá uma ampla gama dinâmica linear. A proteína de interesse deve ser normalizada para uma referência interna que permita flutuações na quantidade de proteína carregada em cada poço ou concentrações diferentes. Isto pode ser conseguido com a manutenção da casa ou com a proteína de picos. A relação entre o sinal e o ruído é importante para se poder quantificar adequadamente a proteína. Isto é da maior importância na detecção de bandas fracas onde se espera um fundo mais elevado.
Exemplos específicos
Embora o peso teórico de muitas proteínas seja diferente do peso real devido a modificações pós translacionais, quase todos os anticorpos comerciais são validados usando WB.
Within the Human Protein Atlas project WB é usado para o controlo de qualidade dos anticorpos policlonais gerados no projecto. Após a purificação, os anticorpos são utilizados para detectar bandas numa configuração de lisado e diferentes tecidos. O uso do siRNA WB é actualmente implementado para uma análise mais aprofundada dos anticorpos.
O protocolo WB completo, incluindo a diluição de anticorpos primários e secundários e o passo final de detecção, é executado de forma rotineira e não é feita nenhuma optimização experimental específica para anticorpos individuais. No início, lisados proteicos totais de linhas celulares e tecidos seleccionados (15?g de RT-4, U-251MG, fígado, e amígdalas, bem como 25?g de plasma com HSA e IgG) e um marcador (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; Thermo Scientific) são carregados em géis de gradiente SDS-PAGE (Laboratórios Bio-Rad) pré-fabricados 4-20% Critério e funcionam em condições de redução, seguidos de transferência para membranas PVDF (Laboratórios Bio-Rad) usando Trans-Blot turbo (Laboratórios Bio-Rad) de acordo com as recomendações do fabricante. Os géis de gradiente SDS-PAGE Critério juntamente com o marcador tornam possível analisar proteínas nos tamanhos que variam entre 10 e 250 kDa. As membranas são então activadas em metanol antes do bloqueio (5% leite seco, 0,5% Tween 20, 1× TBS; 1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl) durante 1 h à temperatura ambiente durante a agitação constante. As membranas são então incubadas com o anticorpo primário HPA diluído a ~0,6?g/ml, durante 1 h, seguido de lavagem (1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween) e incubação durante 45 minutos com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase (anti-coelho suíno 1:4000, Dako). Para os anticorpos comerciais é utilizada uma diluição de 1:500 e o anticorpo secundário é ou anticorpo anti-coelho suíno (1:3000, Dako) ou anti-rato caprino (1:3000, Dako). É utilizada uma câmara CCD (Laboratórios Bio-Rad) para a detecção do sinal do substrato (Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate; Millipore).
Um Western Blot típico de HPA é visto na Figura 5.
Figure 5. Resultado típico de Western Blot usando HRP e uma câmara CCD.
Referências e Ligações
O artigo nomeando o método e descrevendo-o com mais detalhe:
Burnette WN. “Western blotting”: transferência electroforética de proteínas de sulfato de sódio dodecyl-polyacrylamide géis a nitrocelulose não modificada e detecção radiográfica com anticorpos e proteína radioiodinada A&período; Anal Biochem&período; (1981)
PubMed: 6266278
O artigo descreve a técnica, teoria e resolução de problemas da Western Blotting:
Mahmood T et al., Western blot: técnica, teoria, e resolução de problemas. N Am J Med Sci. (2012)
PubMed: 23050259 DOI: 10.4103/1947-2714.100998
p>O primeiro artigo descrevendo a transferência electroforética de proteínas para membrana:
Towbin H et al.., Transferência electroforética de proteínas de géis de poliacrilamida para folhas de nitrocelulose: procedimento e algumas aplicações&período; 1979&período; Biotecnologia&período; (1992)
PubMed: 1422008
Princípios e Métodos de Mancha Ocidental – um manual gratuito fornecido pela GE Healthcare:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-se/service-and-support/handbooksp>Western Blotting in the Human Atlas Protein project:
Western Blotting
Wikipedia – ligações relevantes:
Polyacrylamide gel electrophoresis
Western Blotting encyclopedia – Muita informação útil sobre Western blot, bem como a resolução de problemas, protocolos e selecção de anticorpos:
http://www.western-blot.us
Antibodypedia – Uma base de dados de acesso aberto de anticorpos disponíveis publicamente e a sua utilidade em várias aplicações:
http://www.antibodypedia.com
VIDEO: Passo a passo Western blotting, um tutorial feito por Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu