Wie Rb-Proteine die Zellproliferation kontrollieren, ist nicht vollständig geklärt. Es wurde festgestellt, dass das RB-Protein mit einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren und Chromatin-assoziierten Komplexen assoziiert.
Die Bindung des Rb-Proteins hemmt die Fähigkeit der E2F-Faktoren zur Transkriptionsaktivierung, indem es die Transkriptionsaktivierungsdomäne maskiert und in einigen Fällen die E2F-Faktoren zu Transkriptionsrepressoren macht. Die Bedeutung der Rb-E2F-Interaktion bei der Kontrolle des Zellwachstums wird durch die Erkenntnis belegt, dass allen natürlich vorkommenden Rb-Mutanten, die aus menschlichen Tumoren isoliert wurden, die Fähigkeit fehlt, E2F zu binden und negativ zu regulieren (Qian et al, 1992).
Es wird angenommen, dass Rb-Proteine die Expression von E2F-regulierten Genen auf zwei Arten hemmen (Dyson et al., 2002): durch direkte Bindung und Blockierung der Aktivierungsdomäne von E2F-Proteinen oder durch aktive Repression durch die Rekrutierung von HDAC, SWI/SNF-Faktoren, Proteinen der Polycomb-Gruppe (Dahiya et al, 2001) oder Methyltransferase (Vandel et al, 2001).
Bindung an E2F-Transkriptionsfaktoren
Die E2F-Familie von Transkriptionsfaktoren besteht aus mindestens sieben E2F-Familienmitgliedern, E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5, 2A7E und E2F7.
Ein funktioneller E2F-Transkriptionsfaktor besteht aus einem Heterodimer, das ein E2F-Polypeptid und ein DP-Polypeptid enthält (Helin et al, 1993). Jedes der E2F-Polypeptide kann entweder mit DP1 oder DP2 (DP3) heterodimerisieren (Ormondroyd et al., 1995), obwohl der E2F7-Transkriptionsfaktor DNA auf eine DP-unabhängige Weise bindet.
Es gibt funktionelle und strukturelle Unterschiede innerhalb der E2F-Familie. E2F1, E2F2 und E2F3 sind Transkriptionsaktivatoren, die mit pRB interagieren. E2F4 und E2F5 sind transkriptionelle Repressoren und binden hauptsächlich Rb2/p130 und p107 (Gaubatz et al., 2000). 2A7E scheint keine Taschenprotein-Interaktionsdomäne zu besitzen; es interagiert mit Polycomb-Proteinen und reprimiert die Transkription (Morkel et al., 1997). Die kürzlich identifizierten E2F7 und E2F8 scheinen ebenfalls spezifische Promotoren zu reprimieren (Di Stefano et al., 2003). Der DP-Heterodimerisierungspartner scheint die Bindungsspezifität der E2F-Faktoren für die Taschenproteine nicht zu bestimmen. DP-Faktoren haben jedoch eine Funktion bei der Stabilisierung der Interaktion zwischen E2F-Faktoren und den Rb-Proteinen (Helin et al., 1993).
Während der Zellproliferationsreaktion kommt es zu einer unterschiedlichen Expression der verschiedenen E2Fs, wobei E2F3 im frühen bis mittleren G1 zunimmt und E2F1 und E2F2 an der G1/S-Grenze zunehmen (Johnson et al., 1998). E2F4 und E2F5 werden während des gesamten Zellzyklus exprimiert, aber in G0 und frühem G1 werden sie durch p107 und Rb2/p130 an den Zellkern gebunden und bilden transkriptionelle Repressorkomplexe. p107 und Rb2/p130 rekrutieren E2F4 in die Zellkerne und induzieren die Repression der Transkription von S-Phasen-Genen und die Zellproliferation. Währenddessen wird angenommen, dass pRb E2F1-3 entweder an E2F-responsive Promotoren bindet oder von diesen sequestriert wird (De La Luna et al., 1996).
Nach der Stimulation treten ruhende Zellen in den Zellzyklus ein, und in der frühen G1-Phase wird pRb phosphoryliert und infolgedessen E2F1-3-Transkriptionsfaktoren freigesetzt, während nur in der mittleren bis späten G1-Phase der Verlust von Rb2/p130-Komplexen beobachtet werden kann. In der späten G1-Phase werden also Rb-Proteine phosphoryliert und dissoziieren von E2Fs; E2F4 und E2F5 wandern ins Zytoplasma und E2F1-3 binden an die E2F-responsiven Promotoren an Stellen, die sich oft von der Bindungsstelle der E2F-Repressorproteine unterscheiden (Cinti et al., 2000). Am G1/S-Phasenübergang können noch Komplexe nachgewiesen werden, die p107 in Assoziation mit E2F4 enthalten (Mudryj, 1991). Diese E2F4-p107-Komplexe enthalten auch Cyclin E oder A und cdk2 (Shirodkar, 1992). Es wurde auch gezeigt, dass E2F-p130-Komplexe akkumulieren, wenn einige Zelltypen, einschließlich Myoblasten und Melanozyten, eine terminale Differenzierung durchlaufen (Shin et al., 1995).
pRb und die verwandten Proteine p107 und Rb2/p130 haben keine vollständig redundante Funktion bei der Regulierung der Transkription von E2F-Genen; stattdessen zeigen sie eine große Redundanz auf der Ebene des Zellzyklus. Zum Beispiel gibt es in pRb-/- Fibroblasten einen kompensatorischen Anstieg der p107-Proteinspiegel während des Arrestes in der G0/G1-Phase (Sage et al., 2003). Der Mechanismus dieses antiproliferativen Effekts von p107 ist unbekannt – p107 könnte pRb bei der Regulation von E2F1-3 ersetzen oder es könnte einige E2F-responsive Gene, die von pRb kontrolliert werden, repressieren (Lee et al., 2002). Darüber hinaus kann pRb auch E2F4 in vitro binden, reguliert aber nicht den E2F-responsiven Promotor in p107-/- und p130-/- Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass der pRb-E2F4-Komplex in p107-/–Zellen nicht die gleichen Promotorstellen bindet, die normalerweise durch den p107-E2F4-Komplex in Wildtyp-Zellen verknüpft werden (Rayman et al., 2002).
Allerdings ist pRb an der Repression einer begrenzten Anzahl von E2F-Genen in G0- und G1-Zellen beteiligt, und vor kurzem wurde seine Rolle bei der Repression des Cyclin-E-Gens definiert. Tatsächlich ist der Cyclin E-Promotor in Zellen, die pRb verloren haben, dereguliert, obwohl der p107/p130-E2F4-Komplex noch vorhanden ist (Herrera et al., 1996). pRb vermittelt die Repression des Cyclin E-Promotors durch die Rekrutierung von HDAC und Histon-Methyltransferase an einer bestimmten E2F-SP1-Stelle, die ausschließlich durch die pRb-E2F1-3-Komplexe verbunden ist. Cyclin E wird nicht nur durch den Verlust von pRb, sondern auch durch den Verlust von E2F1-3-Proteinen dereprimiert, so dass klar ist, dass E2F1-3-Proteine in diesem Fall als Repressoren statt als Aktivatoren wirken (Wu et al, 2001). p107 oder Rb2/p130 können pRb nur ersetzen, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, um E2F1-3-Proteine zu binden (Lee et al., 2002).
pRb kann die Proliferation durch einen E2F-unabhängigen Mechanismus hemmen. Zum Beispiel kann pRb die Bildung von Kernkörpern der promyelozytären Leukämie (PML) induzieren (Fang et al., 2002), die Expression von p27 erhöhen (siehe oben), die Ras-Signalisierung unterdrücken (Lee et al., 2002) und kooperieren mit hLin-9, einem Protein, das ähnlich wie pRb an der Unterdrückung der Transformation beteiligt ist, aber auf eine E2F-unabhängige Weise (Gagrica et al., 2004).
RB/E2F-Repressor-Komplexe können auch auf eine Cdk-unabhängige Weise reguliert werden. Zum Beispiel rekrutiert der transformierende Wachstumsfaktor-β E2F4/p107 und E2F5/p107 durch den c-myc-Promotor unabhängig von der Zellphase, und er ist auch bei hoher Cdk-Aktivität stabil (Chen et al., 2004). In menschlichen Zellen wurde festgestellt, dass p107 und p130 während der S-Phase von zellzyklusregulierten Genpromotoren entfernt werden, aber immer noch an den Promotoren von apoptotischen Genen lokalisiert sind (Young et al., 2004). Die Cdk-unabhängige Regulation des RB/E2F-Komplexes ist noch nicht gut verstanden.
Bindung an Proteine, die die Chromatinstruktur modifizieren
Die Repression durch Rb-Proteine erfordert die konservierten A- und B-Domänen des Taschenproteins und scheint neben den E2F-Faktoren auch die Assoziation anderer Proteine zu beinhalten. Rb-Proteine unterdrücken die Transkription durch Umbau der Chromatinstruktur durch Interaktion mit Proteinen wie hBRM, BRG1, HDAC1 und SUV39H1 (Shao et al., 1995), die jeweils am Nukleosomenumbau, der Histonacetylierung/-deacetylierung und der Methylierung beteiligt sind.
hBRM und BRG1 sind Säuger-Homologe von Komponenten des Hefe-Chromatinumbaukomplexes SNF2/SWI2 (Strober et al., 1996). Sowohl BRG1 als auch hBRM assoziieren mit pRB und sind in die pRb-vermittelte Repression involviert. Eine physische Interaktion zwischen pRb und BRG1 ist für den pRB-induzierten Wachstumsstillstand und die transkriptionelle Repression von E2F-Zielgenen nicht erforderlich (Kang et al., 2004).
Die Histondeacetylase 1 ist ein HDAC, von dem kürzlich gezeigt wurde, dass er von pRb an E2F-Komplexe rekrutiert wird und bei der Repression der Cyclin-E-Genexpression eine Rolle spielt (Magnaghi-Jaulin et al., 1998). Histone sind in der Regel an den Promotoren von aktiv transkribierten Genen hyperacetyliert, während sie an silenced Genen hypoacetyliert sind. Histondeacetylase wird im Allgemeinen von vielen Transkriptionsregulatoren an Genpromotoren rekrutiert. pRB assoziiert mit HDAC-Aktivität in vivo und bindet in vitro an Klasse I HDACs (HDAC1-HDAC3). Die pRB-vermittelte Repression wird durch HDAC1 in transienten Transfektionsexperimenten verstärkt. Um diese Assoziation zwischen pRb und HDAC zu bestätigen, wurde gezeigt, dass die Hemmung der HDAC-Aktivität mit Trichostatin A die pRB-vermittelte Repression an einer Untergruppe von E2F-regulierten Promotoren beeinträchtigt (Zhang et al., 2000). Die Histon-Deacetylase ist also an der Modulation der repressiven Aktivität von pRb an E2F-Genpromotoren beteiligt. Die Rekrutierung von HDAC kann indirekt erfolgen und von der Rekrutierung anderer Bindungsproteine wie RBP1, Corepressoren und Chromatin-Remodeling-Proteinen begleitet sein (Lai et al., 1999). Rayman et al. (2002) haben gezeigt, dass in Rb-/- Zellen HDAC auf E2F-Genpromotoren sitzt; dies ließ uns die Hypothese aufstellen, dass pRb nicht strikt für die transkriptionelle E2F-Repression notwendig ist, sondern dass andere Mechanismen beteiligt sein könnten. Histon-Acetyltransferase-Proteine (CCBP, p300, Tip6, etc.) sind an der Aktivierung von E2F-Proteinen beteiligt (Condorelli und Giordano, 1997); sie interagieren mit der Aktivierungsdomäne der E2F-Proteine und stimulieren deren Aktivierung.
SUV39H1 ist eine Methyltransferase, die spezifisch K9 von Histon H3 methyliert und mit pRb bei der Repression des Promotors von E2F-responsiven Genen kooperiert. In Zellen, denen pRb fehlt, gibt es keine Assoziation von me-K9-H3 in diesen Promotoren (Rea et al., 2000); diese Ergebnisse wurden insbesondere durch die Untersuchung von Cyclin E, einem der besten E2F-Zielgene, das durch pRb moduliert wird, entwickelt. Sowohl pRb als auch SUV39H1 sind direkt an der Repression der Cyclin E-Transkription beteiligt, da sowohl in pRb-/- als auch in SUV39H1-/- Doppelknockout-Zellen Cyclin E überexprimiert wird. Rb-Proteine sind auch in der Lage, die Assemblierung von Prä-Initiationskomplexen zu verhindern und damit die Aktivität von Transkriptionsfaktoren zu hemmen, die an E2F-Genpromotoren rekrutiert werden (Ross et al., 1999).
Die Art der Repression, die Rb-Proteine auf das Zellwachstum ausüben, hängt von der Art der Corepressor-Proteine ab, die E2F-Zielgene binden. Zum Beispiel können verschiedene Arten der transkriptionellen Repression am gleichen Promotor in einem anderen zellulären Zustand oder in einem anderen Zellphänotyp wirken (Dimova und Dyson, 2005).
Der pRb/E2F-Komplex kann auch eine stabile Repression unabhängig von der Position im Zellzyklus oder durch Resistenz gegenüber der Zellzyklusprogression fördern. Leider sind die Mechanismen, durch die pRb an Prozessen beteiligt ist, die die E2F-abhängige Transkription dauerhaft unterdrücken, bisher nicht gut bekannt. Zum Beispiel kann E2F4 an E2F-regulierten Promotoren in der S-Phase gefunden werden, aber es ist unklar, ob es als Aktivator wirkt. Seneszente Zellen zeigen z. B. eine höhere H3K9-Methylierung an E2F-responsiven Promotoren im Vergleich zu ruhenden Zellen (Narita et al., 2003). Rb-Proteine vermitteln E2F-responsive Gene sowohl im quieszierenden als auch im seneszenten/differenzierten Zustand, wobei ersterer durch niedrige und letzterer durch hohe H3K9-Methylierung gekennzeichnet ist. Die Identität der Histon-Methyltransferase, die am Promotor rekrutiert wird, kann auch den Übergang zwischen einer ruhenden Zelle und einer seneszenten/differenzierten Zelle modulieren.