Pflanzenmaterial, Kulturbedingungen und Wurzelbehandlungen
Wildtyp Medicago truncatula-R108-Sämlinge, die für diese Studie verwendet wurden, wurden 2008 am INRA-Montpellier, Frankreich, geerntet und bei – 20 °C in einem Röhrchen konserviert, dessen Leerraum mit hydrophiler Baumwolle gefüllt war, um Feuchtigkeit zu reduzieren. Die Samen wurden mit Sandpapier (Körnung P80) leicht angeritzt und anschließend 30 min unter Rühren in einer Lösung sterilisiert, die durch Auflösen von 1/4 einer handelsüblichen Bleichtablette in 250 mL Wasser mit 30 µL Detergenz hergestellt wurde. Die Samen wurden dann dreimal gründlich in sterilem Wasser unter einer laminaren Strömung gewaschen. Wenn noch Detergenz vorhanden war, wurden zusätzliche Waschschritte durchgeführt. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Samen 1 h in Wasser bei Raumtemperatur zur Imbibition gehalten. Überschüssiges Wasser wurde entfernt und die Samen wurden wahllos auf Wassermedium 1% Agar (HP 696-Kalys) verteilt. Die Platten wurden kopfüber bei 4 °C im Dunkeln für 3 bis 4 Tage der Stratifikation aufgestellt. Schließlich erfolgte die Keimung bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht, wobei die Platten kopfüber gehalten wurden, um ein gerades Wurzelwachstum außerhalb des Agars zu ermöglichen und den weiteren Transfer auf ein neues Kulturmedium zu erleichtern. Die Keimlinge wurden dann auf modifiziertem Fahraeus-Medium, verfestigt mit 1,3% Agar (HP 696-Kalys), kultiviert (modifiziertes Fahraeus-Medium: CaCl2 1 mM, MgSO4 0,5 mM, KH2PO4 0,7 mM, Na2HPO4 0,8 mM, Fe EDTA 50 μM, je 0,1 mg/L der folgenden Mikroelemente: MnSO4, CuSO4, ZnSO4, H3BO3 und Na2MoO4, pH-Wert eingestellt auf 7,5 mit KOH) . Pro quadratischer Petrischale (12 cm × 12 cm), die das Kulturmedium enthielt und mit einem inerten, saugfähigen Papier (Mega International-USA) abgedeckt war, um ein Durchwurzeln zu vermeiden, wurden maximal 8 Keimlinge mit Wurzeln um 1 cm übertragen. Während des Transfers wurden 125 µL steriles Milli-Q-Wasser zu jeder Wurzel hinzugefügt, um ein Austrocknen zu verhindern, bevor die Boxen mit Millipore-Band verschlossen wurden. Schwarze Taschen wurden verwendet, um den unteren Teil der Schale abzudecken, um die Wurzeln vor Licht zu schützen. Schließlich wurden die Schalen in einem Winkel von etwa 45° zur Vertikalen in Kulturräumen positioniert, in denen Bedingungen von 24 °C, 60 % Luftfeuchtigkeit und 16 h Beleuchtung herrschen.
Um den RHS-Algorithmus zu testen, wurden die Wurzeln verschiedenen Behandlungen unterzogen. Eine erste Gruppe von unbehandelten Pflanzen wurde 3 Tage nach dem Transfer kultiviert, bevor die Wurzeln unter dem Mikroskop abgebildet wurden. Für behandelte Bedingungen wurden 2 Tage nach dem Transfer die Schalen geöffnet und horizontal aufgestellt, um 20 mL Behandlungslösungen hinzuzufügen, die entweder aus 10 nM Nod-Faktor (NF) oder 10 µM Indol-3-Essigsäure (IAA), verdünnt in sterilem Milli-Q-Wasser, bestanden. Als Kontrolle wurden die Pflanzen mit sterilem Milli-Q behandelt. Nach 1 h Eintauchen der Wurzeln wurde überschüssige Flüssigkeit entfernt und die Schalen wurden verschlossen und für 18 h in den Kulturraum zurückgestellt.
Arabidopsis thaliana (Col0) Samen wurden für 3 h mit Chlorgas oberflächensterilisiert, das durch Mischen von 3 mL HCl 37% mit 50 mL Natriumhypochlorit 10% hergestellt wurde. Die Samen wurden in einer quadratischen Schale (12 cm × 12 cm) ausgebreitet, die mit 1/2MS-Medium gefüllt war, das mit 0,8% Pflanzenagar (Duchefa) geliert war. Die Schale wurde für 2 Tage im Dunkeln bei 4 °C zur Stratifizierung und anschließend bei 21 °C, 16 h Beleuchtung zur Keimung und Kultur gelagert. Nach 9 Tagen wurden die Keimlinge für die Bildaufnahme verwendet.
Brachypodium distachyon (Bd21-3) Samen wurden mit einer Pinzette von der Schale geschält, dann 15 min auf einer Wippe in 1 mL Sterilisationspuffer (20 % Haushaltsbleiche, 0,1 % Tween20) sterilisiert und 4 mal in doppelt destilliertem Wasser gespült. Die Samen wurden in eine quadratische Schale (12 cm × 12 cm) gelegt, die mit 1/2MS, ergänzt mit 1% Agar, gefüllt war, wobei der Embryonenpol der langen Achse des Samens nach unten zeigte. Nach 2 Tagen Stratifikation bei 4 °C wurden die Schalen transferiert und zur Keimung vertikal in eine Wachstumskammer bei 28 °C und 16 h Beleuchtung gestellt. Die Keimlinge waren 3 Tage nach der Keimung bereit für die Bildgebung.
Bildaufnahme
Bevor die verschiedenen Schritte der Methode im Detail beschrieben werden, ist die gesamte Pipeline, die den gesamten Prozess, der die Bildgebung, die Fiji-Script-Analyse, die Datensortierung und den Sigmoid-Fit umfasst, in Zusatzdatei 2 zusammengefasst: Abbildung S6.
Drei Tage nach dem Transfer in die Wachstumskammer (d.h. 18 h nach spezifischen Behandlungen, falls zutreffend) wurden die Wurzeln von den oberirdischen Organen exzidiert und zwischen Objektträger und Deckglas in flüssiges Fahareus-Medium gelegt. Mit einem Hellfeldmikroskop (Leica DMI6000 mit motorisiertem Tisch x, y, z. LAS-Software, Halogen-Leica-Lampe, 5× Dry-Objektiv mit 0,15 numerischer Apertur, Hamamatsu Orca ER-1395 Kamera) wurden Bilder mit einer Auflösung von 19.703 ppi aufgenommen. Die RH-Breite wird im Durchschnitt von 10 Pixeln abgedeckt. Der motorisierte Tisch des Mikroskops und die Mosaik-Rekonstruktionsmöglichkeiten der LAS-Software wurden verwendet, um alle analysierten Bilder aufzunehmen und zu rekonstituieren (analoge Werkzeuge sind in ImageJ und Fiji frei verfügbar). Die genaue Auswahl des zu erfassenden Endes der Wurzelzone ist nicht erforderlich, da diese Auswahl später mit dem sigmoidalen Modell standardisiert wird. Um scharfe Bilder von RHs entlang der Wurzel zu erhalten, wurden Z-Stapel von fünf Bildern im Abstand von 100 µm aufgenommen.
Aufhellungsbilder von Arabidopsis-Wurzeln wurden mit einer Auflösung von 15.631 ppi aufgenommen, indem die geöffnete Kulturbox direkt unter ein Nikon SMZ18 Stereoskop gestellt wurde, das mit einem 0,5× Nikon SHR Plan Apo WD:71 Objektiv, Zoom 8 und einer Hamamatsu C11440 Kamera ausgestattet war. Pro Wurzel wurden drei XY-Positionen aufgenommen, indem der Kasten unter dem Sichtfeld manuell so bewegt wurde, dass sich zwei aufeinanderfolgende Bilder überlappten. Ein Z-Stapel war nicht notwendig.
Brachypodium-Keimlinge wurden zwischen Objektträgern und mit Wasser gefüllten Deckgläsern abgebildet, wobei die Blätter vom Deckglas unbedeckt blieben. Die Bilder wurden mit dem gleichen optischen System wie für Arabidopsis-Sämlinge aufgenommen, mit einer Endvergrößerung von 40×. Pro Wurzel wurden zwei XY-Positionen aufgenommen, um 2 aufeinanderfolgende Bilder überlappen zu lassen. Ein Z-Stapel war nicht notwendig.
Die für Arabidopsis und Brachypodium aufgenommenen XY-Bilder wurden in Fiji mit dem Plugin 2D Stitching zusammengefügt. Wenn die Bildüberlappung für 2D Stitching nicht ausreichte, wurde das Stitching manuell mit dem Plugin MosaicJ durchgeführt.
Root Hair Sizer: Bildverarbeitung
Die gesamte Bildverarbeitung wurde mit der Open-Source-Software Fiji durchgeführt, kann aber auch in der Open-Source-Software ImageJ mit den installierten Plugins AnalyzeSkeleton und Auto_Threshold durchgeführt werden. Als Ausgangspunkt wird ein einzelnes Bild benötigt, auf dem alle RHs fokussiert sind. Hier haben wir Z-Projektionen durch Summierung von fünf erfassten Schichten erzeugt, aber jede Erfassungs- und Verarbeitungsmethode, die ein einzelnes scharfes Bild der RHs entlang der Wurzel erzeugt, kann verwendet werden.
Der Rest der Verarbeitung kann durch Ausführen des RHS-Algorithmus erfolgen, der in Additional file 1: Script 1 verfügbar ist. Eine Zusammenfassung aller Schritte des Algorithmus ist auch in Tabelle 1 verfügbar und in Abb. 2 und Zusatzdatei 2 dargestellt: Abb. S5. Zur Verdeutlichung des Verständnisses der Schnittstelle ist zusätzlich die Zusatzdatei 5: Film 1 verfügbar. Der erste Teil der RHS-Verarbeitung besteht aus der Erkennung des RHs-Bereichs. Die Methode, die von Inoue et al. inspiriert wurde, besteht aus einem Schwellenwert für die Pixelintensität. Ein erster Prozess erkennt den Umriss der RHs, während ein zweiter nur den Umriss der Wurzel verarbeitet. Um die manuelle Definition der Pixelintensitätsschwelle zu vermeiden, wurde ein automatisches Thresholding verwendet. Die Erkennung der Wurzel mit RHs wurde mit der Bernsen-Methode erreicht, während die Wurzelachse allein mit der Phansalkar-Methode erkannt wurde (Zusätzliche Datei 2: Abb. S7 und Tabelle 1-Schritte 3 und 4) . Um die beiden erzeugten Binärbilder zu glätten und Löcher zu füllen, wurden mehrere Schritte der Pixeldilatation und Erosion angewendet (Tabelle 1-Schritte 3.2 und 4.2). Das Bild der Wurzelachse wurde dann vom gesamten Wurzelbild (Wurzel mit RHs) subtrahiert (Zusätzliche Datei 2: Abb. S7 und Tabelle 1-Schritt 5), um nur die von RHs bedeckte Oberfläche zu erhalten. Hintergrundrauschen wurde in Schritt 5.2 gelöscht (Tabelle 1-Schritt 5.2).
Da die nachfolgenden Schritte erfordern, dass die Wurzel gerade ist, wird die Wurzelmittellinie (RML) als der längste Pfad des Skeletts wiederhergestellt, das aus dem Wurzelachsenbild nach Ausführung der Befehle „Skeletonize“ und „Analyse Skeleton (2D/3D)“ erhalten wurde (Zusätzliche Datei 2: Abb. S7 und Tabelle 1-Schritte 8.1 und 8.2). Das RML-Bild wird dann in eine polylineare Auswahl umgewandelt (Schritte 8.3 und 8.4) und mit dem Fiji-Befehl ‚Straighten‘ begradigt (Zusätzliche Datei 2: Abb. S7 und Tabelle 1-Schritt 10). Da ‚Straighten‘ ein Graustufenbild erzeugt, wird zusätzlich eine Binarisierung durchgeführt (Tabelle 1-Schritte 11 und 12). Im endgültigen Bild haben die RH-Pixel den Wert 1 und die Hintergrundpixel den Wert 0.
Root Hair Sizer: RH-Längenmessung
Die Messung der Wurzelhaarlänge erfolgt in zwei Schritten, wie im Abschnitt „Ergebnisse“ (Abb. 2) beschrieben. Zunächst wird eine rechteckige Auswahl entlang der Wurzelachse des begradigten, binarisierten Bildes der RHs verschoben, wobei die Höhe „L“ der RH-Oberfläche innerhalb der Auswahl bei jedem Schritt (Tabelle 1-Schritte 14.1 bis 14.3) mit Formel (1) gemessen wird. Zweitens wurde eine bestimmte Anzahl (typischerweise 10) aufeinanderfolgender individueller L-Werte maximal gefiltert, um einen Lmax-Wert als Schätzung der RH-Länge zu erhalten (Tabelle 1-Schritte 14.4 bis 14.5). Jeder Lmax-Wert wird mit einem entsprechenden Abstand von der Wurzelspitze assoziiert und in eine Tabelle geschrieben.
Root Hair Sizer: anpassbare Einstellungen
Abhängig von der Art der Wurzel und den Eigenschaften des aufgenommenen Bildes, kann es notwendig sein, einige Einstellungen anzupassen. Die anpassbaren Schritte sind im RHS-Skript mit mehreren Sternchen hervorgehoben, während die Einstellungen, die wir in den gezeigten Medicago-Beispielen verwendet haben, in Tabelle 1 aufgeführt sind. Beim Thresholding des Bildes kann der Radiuswert für die Bernsen- und Phansalkar-Schwellwertmethode z. B. für Bilder mit unterschiedlicher Auflösung angepasst werden, ebenso wie die Anzahl der direkt danach angewendeten Erosionen und Dilatationen. Wenn sich das Wurzelhaarprofil und die Art des optischen Aufbaus, der für die Aufnahme verwendet wurde, stark von dem hier vorgestellten Beispiel unterscheiden, werden die Anwender ermutigt, die Schwellenwertstrategie an ihre eigenen Einstellungen anzupassen. Für Arabidopsis-Wurzeln wurde zum Beispiel in Schritt 3 die Phansalkar- statt der Bernsen-Schwellwertmethode verwendet, um die RH-Form zu erkennen, während in Schritt 4 die Bernsen- statt der Phansalkar-Schwellwertmethode verwendet wurde, um die Wurzelform zu erkennen. Außerdem war Schritt 5 nicht mehr notwendig (Zusätzliche Datei 4: Skript 4). Auch der Prozess der Wurzelskelettierung muss eventuell angepasst werden. Der Grad der Vereinfachung der Polylinie, die die mittlere Wurzellinie hervorhebt, die nach den Befehlen „Skelettieren“ und „Skelett analysieren (2D/3D)“ erhalten wurde, kann für viel größere oder kleinere Bilder angepasst werden. Bei der Begradigung ist es schließlich wichtig, die Breite der Polylinie so einzustellen, dass sie alle RHs abdeckt.
Bei der Ausführung von RHS kann der Anwender in einem Dialogfeld das zu analysierende Wurzelsegment auswählen. Die Breite w der Scan-Auswahl kann so eingestellt werden, dass sie etwas dünner als eine RH ist (von 1/2 bis 2/3). Schließlich kann auch die Intervallgröße, in der Lmax gewählt werden soll, angepasst werden. Ein Intervall von 10 Auswahlen zur Erfassung von Lmax schien in den hier gezeigten Beispielen genau zu sein. Die Auswirkung der Variation dieses Parameters, der die Menge der beibehaltenen Datenpunkte gegenüber der Datenvariabilität aufgrund von z. B. „Löchern“ im RH-Profil regelt, ist in Zusatzdatei 2 dargestellt: Abb. S8).
Root Hair Sizer schlägt außerdem vor, das Bild zu kommentieren, wenn einige Teile der Wurzel aus der Analyse entfernt werden müssen. Die Position dieser Kommentare entlang der Wurzel wird in der endgültigen Tabelle durch die Annotation jedes Datenpunktes als 1 und 0 (bzw. das Vorhandensein und Nichtvorhandensein des Kommentars an diesem Punkt) auf getrennten Spalten wiederhergestellt. Darüber hinaus ermöglicht RHS dem Benutzer in mehreren Schritten, den durch den Algorithmus erreichten automatischen Prozess zu überprüfen und eventuell manuell zu korrigieren. Alle automatischen Definitionen und manuellen Korrekturen werden aufgezeichnet und als Region of Interest (ROI) gespeichert. Nachdem RHS ein erstes Mal ausgeführt wurde, ist es möglich, eine andere Region der Wurzel zu analysieren und dabei ROI zu verwenden, die mit dem Originalbild verbunden sind, indem das Skript verwendet wird, das in Zusatzdatei 6: Skript 2 vorgestellt wird. Um dieses Skript auszuführen, ist es wichtig, die gleiche RML-Breite zu verwenden und das erste Dialogfeld mit den gleichen Kommentarnamen zu füllen, die beim Hauptalgorithmus von RHS verwendet werden.
Datenverarbeitung
Die mit RHS gesammelten Daten werden mit der Tabellenkalkulations-Software Excel sortiert. Für alle dargestellten Ergebnisse wurden Regionen, die ein Artefakt (z. B. eine Blase oder Staub) aufweisen, aus der Analyse entfernt. Bei einigen Bildern zeigte eine Seite der Wurzel eine kleinere RH über die gesamte Länge im Vergleich zur anderen Seite, meist bei nebeneinander wachsenden Wurzeln. In diesen Fällen wurde nur die Seite mit der längeren RH für die Analyse beibehalten. Andere spezifische Datensortierungen oder Parameter werden in den Bildlegenden oder im Text erwähnt. Wie oben in „Ergebnisse“ beschrieben, gehen wir zur genauen Anpassung der Datenpunkte mit zwei aufeinanderfolgenden Sigmoid-Fitten vor. Dann, wie in den Abbildungen Fig. 3b, Additional file 2: Abb. S3, S4, erhalten wir eine gute Schätzung des Abschnitts der Kurve, der eine sigmoide Form aufweist.
Die Daten wurden mit der sigmoiden Kurve \(f\left( d \right)\)
Dieser erste Fit liefert den Knickpunkt d50_1 und die Auszugslänge δ_1. Anschließend werden die Grenzen für den zweiten Fit zwischen d50_1 ± 5δ_1 festgelegt.
Die sigmoidale Anpassung wurde mit der Software GraphPad Prism durchgeführt. Die Daten aus jedem Bild wurden separat behandelt. Eine Anpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate wurde unter Verwendung der folgenden Regeln angewendet, um die Anfangswerte der Anpassung für jedes betrachtete Bild zu definieren:
Mit Labsolute min und Labsolute max ist die minimale bzw. maximale RH-Länge gemeint, die in allen Daten entlang der gesamten Wurzel des betrachteten Bildes gemessen wurde.
Messung der Wurzelwachstumsrate
Diese Messung wurde an separaten Chargen von Wurzeln unter den gleichen Bedingungen wie bei der RH-Längenmessung durchgeführt. Nach 1 h Eintauchen der Wurzeln in die Behandlungslösung wurden die Kästen geleert, dann verschlossen und die RT-Position mit einem Marker auf dem Kastendeckel markiert. Nach 18 h Inkubation wurde die neue RT-Position markiert und die Box gescannt. Der Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Punkten wurde dann mit der Fiji-Software gemessen. Die Wurzelwachstumsrate kann als das Verhältnis dieses Abstands durch die Zeit zwischen den beiden Messungen gemessen werden. Das Wurzelwachstum wurde an zwei biologischen Replikaten gemessen und ergab die folgenden Werte (Mittelwert ± SE): unbehandelt: 296 ± 17 µm/h (n = 26); H2O: 304 ± 16 µm/h (n = 26); NF: 225 ± 15 µm/h (n = 23); IAA: 55 ± 3 µm/h (n = 19).
Statistik
Die Software GraphPad Prism wurde für die statistische Analyse und die sigmoidale Anpassung verwendet. Alle Details zu Stichprobengröße, biologischen Replikaten oder geführten Tests sind in den Abbildungslegenden angegeben.