Targeting a moonlighting function of aldolase induces apoptosis in cancer cells

Seit Otto Warburgs Entdeckung, dass Krebszellen eine extrem hohe Rate an Glukoseaufnahme und Laktatproduktion aufweisen1, hat eine Vielzahl von Studien gezeigt, dass die Mehrheit der Krebszellen auf glykolytische Energieproduktion angewiesen ist2. Dies hat Labore weltweit dazu angeregt, nach Inhibitoren der Glykolyse als potenzielle Krebsmedikamente zu suchen.

Doch die biologische Bedeutung der sehr hohen Expression glykolytischer Enzyme in Krebserkrankungen ist rätselhaft. Das erste Enzym der Glykolyse, die Hexokinase, wird im Vergleich zu den nachfolgenden Enzymen auf einem niedrigeren Niveau exprimiert3 und hat eine relativ geringe spezifische Aktivität und Affinität zu Substraten4,5. Daher begrenzt ihre Gesamtaktivität den Fluss durch die Glykolyse. Daher kann das Überangebot an glykolytischen Enzymen in Krebszellen keinen schnelleren Glukose-Katabolismus fördern, sondern muss mit anderen, nicht-katalytischen Prozessen assoziiert sein.

Glykolytische Enzyme gehören zu den „moonlighting enzymes „6,7 , deren physiologische Rolle nicht auf die katalytische Funktion beschränkt ist und die als Regulatoren einer Vielzahl von zellulären Prozessen wirken können. Wir präsentieren Beweise dafür, dass ein glykolytisches Enzym, die Aldolase, ein mächtiges Ziel in der Anti-Krebs-Therapie sein kann und dass die Unterbrechung eines komplexen Netzes von intrazellulären Interaktionen, die durch das Enzym vermittelt werden, entscheidend für seine Anti-Krebs-Wirkung ist.

Aldolase ist in der Mitte des glykolytischen Weges positioniert und katalysiert die reversible Spaltung von Fructose-1,6-Bisphosphat (FBP) zu Dihydroxyaceton-3-phosphat und Glyceraldehyd-3-phosphat. Seine Muskel-Isoform (ALDOA), die die am häufigsten vorkommende Aldolase-Isoform in fast allen Krebsarten ist8, kann Aktinfilamente9,10 organisieren, die Aktivitäten von AMPK11,12 und FBP213 beeinflussen und die Wnt14,15 und p53-Signalisierung16 regulieren. Es wurde auch gezeigt, dass ALDOA an der Progression der S/G1-Phase des Zellzyklus beteiligt ist17. Da ALDOA an vielen zellulären Ereignissen beteiligt ist, die für das Überleben und die Proliferation von Krebszellen notwendig sind, stellten wir die Hypothese auf, dass die Unterbrechung der Moonlighting-Funktionen von ALDOA ein bevorzugtes Ziel für die Krebstherapie darstellen könnte.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass in Krebszellen, aber nicht in normalen Zellen, die Störung der ALDOA-Interaktion mit dem Aktinzytoskelett eine Abfolge von intrazellulären Veränderungen provoziert, einschließlich einer signifikanten Erhöhung der ROS-Produktion, der Einstellung der ATP-Synthese und des Anstiegs des Kalziumspiegels, was zu einer Caspase-Aktivierung und Blockade der Zellproliferation führt. Da der Mechanismus dieser Veränderungen unabhängig von der katalytischen Funktion von ALDOA ist, schließen wir, dass die Überexpression von ALDOA in Krebszellen nicht mit ihren hohen glykolytischen Anforderungen zusammenhängt, sondern eine Anpassung darstellt, durch die metastatische Krebszellen die Integrität ihres Aktin-Zytoskeletts sicherstellen, während sie den epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen.

UM0112176 – ein neuartiger ALDOA-Inhibitor – reduziert signifikant das Wachstum von Krebszellen

Um die Interaktion von ALDOA mit seinen Bindungspartnern zu stören, verwendeten wir einen langsam bindenden gemischten Inhibitor von ALDOA (UM0112176; ergänzende Abb. S1a), den wir durch Hochdurchsatz-Screening der großen Substanzbibliothek an der Universität Montreal gefunden haben. UM0112176 hemmte die humane ALDOA-Aktivität mit IC50 ∼ 2-5 μM in einer langsam bindenden Weise (ergänzende Abb. S1b, c), ohne andere glykolytische Enzyme zu hemmen (ergänzende Abb. S1d). Wir überprüften die Fähigkeit von UM0112176, die ALDOA-Aktivität in vivo zu hemmen, indem wir die zellulären Spiegel von Fructose-1,6-Bisphosphat und Triosephosphaten nach 24-stündiger Inkubation der Zellen in Gegenwart des Inhibitors bestimmten (Ergänzende Abb. S1e). Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg des Titers des ALDOA-Substrats und eine starke Abnahme der ALDOA-Reaktionsprodukte sowohl in Krebszellen (KLN205, Plattenepithelkarzinom der Maus) als auch in normalen Zellen (Primärkultur von Rattenastrozyten). Dies wird durch den beobachteten inversen Trend unter Verwendung von Zellkulturmedien, die nur Glutamin enthalten, unterstützt.

Als nächstes haben wir eine Dosis-Wirkungs-Kurve von UM0112176 bestimmt und festgestellt, dass 10 µM UM0112176 das Wachstum aller getesteten Krebszelllinien stark reduziert: KLN205, hNSCLC (humane nicht-kleinzellige Lungenkrebs-Zelllinie), BxPC3 (humanes Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse) und AsPC1 (humanes Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse mit Aszites-Metastasen) (Abb. 1a). Die Wachstumsrate normaler Zelllinien (Ratten-Astrozyten, Maus-Kardiomyozyten-HL-1-Zelllinie und eine menschliche Epithelzelllinie-ME16C) wurde durch 10 µM UM0112176 praktisch nicht beeinflusst (Abb. 1a). Eine verlängerte 7-tägige Behandlung mit 10 µM UM0112176 reduzierte die Anzahl der Krebszellen um das Vierfache, während die Anzahl der normalen Zellen nur um 25-30% abnahm (Abb. 1b).

Um zu unterscheiden, ob die Hemmung der zellulären Wachstumsrate auf eine erhöhte Mortalität oder eine Blockade der Proliferation zurückzuführen ist, haben wir die zelluläre Expression von Ki67 (ein Marker der zellulären Proliferation) und der aktiven Caspase (Caspase 3, der finale Effektor in der Apoptose) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass in Krebszellen 10 µM UM0112176 (24 h Behandlung) das Ki67-bezogene Fluoreszenzsignal stark verringerte (Abb. 1c) und das Vorhandensein von aktiver Caspase erhöhte (Abb. 1d). In normalen Zellen wurden auch nach 48-h-Behandlung keine Veränderungen beobachtet (Abb. 1d) (ergänzende Abb. S2a).

UM0112176-Behandlung stört Aktin-Zytoskelett und verändert ROS, mitochondriales Membranpotential, Ca2+, DSB und ATP-Spiegel in Krebszellen, aber nicht in normalen Zellen

Um den Wirkmechanismus von UM0112176 aufzuklären, untersuchten wir eine Reihe von zellulären Aktivitäten, die möglicherweise durch den Inhibitor beeinflusst werden, Dazu gehören die Morphologie des Zytoskeletts, die ATP-Konzentration, der Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), das mitochondriale Membranpotenzial und die DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Die ausgeprägteste Manifestation der Inhibitorwirkung war ein vollständiges Verschwinden der F-Actin-Stressfasern in Krebs-, nicht aber in normalen Zellen nach 24 h Inkubation mit dem Inhibitor (Abb. 1e). Interessanterweise war der Beginn des Abbaus von polymerem Aktin viel schneller (<5 min) (ergänzende Abb. S3a) als die vollständige Hemmung von ALDOA in vitro (∼15 min). Dies unterstützt die Hypothese, dass die F-Aktin-Depolymerisation nicht von der Hemmung der ALDOA-Aktivität abhängt.

Zusammen mit der Störung des Zytoskeletts beobachteten wir einen signifikanten Anstieg der ROS- und Kalziumspiegel, eine Abnahme der ATP-Konzentration und des mitochondrialen Membranpotentials sowie die Induktion von Doppelstrang-DNA-Brüchen (Abb. 2a-e). Wichtig ist, dass die UM0112176-induzierten Veränderungen in den Krebszellen nicht auf normale Zellen übertragen wurden (z. B. durch ROS-Freisetzung): Die UM0112176-Behandlung von KLN205-Zellen, die mit normalen menschlichen Fibroblasten kokultiviert wurden, erhöhte den ROS-Spiegel nur in den Krebszellen (ergänzende Abb. S3b).

UM0112176-induzierte Veränderungen können nicht durch Hemmung der Glykolyse erklärt werden

Um weiter zu untersuchen, ob UM0112176-induzierte Veränderungen durch Hemmung der Glykolyse in Krebszellen reproduziert werden können, testeten wir die Auswirkungen anderer glykolytischer Enzyme als Effektoren: Alizarin Rot S, das die Phosphoglycerat-Mutase (PGAM)18 hemmt, und 3-PO ((2E)-3-(3-Pyridinyl)-1-(4-Pyridinyl)-2-propen-1-on), das indirekt die Wirkung von 6-Phosphofructo-2-Kinase/Fructose-Bisphosphatase-2 (PFK-2)19 blockiert. Die Hemmung von PGAM führte zu einem Anstieg der ROS (ergänzende Abb. S4a), der keinen Einfluss auf den zytoplasmatischen Kalziumspiegel hatte, während die Hemmung von PFK-2 den zytoplasmatischen Ca2+-Spiegel ohne Veränderungen der ROS erhöhte (ergänzende Abb. S4a, b). Darüber hinaus waren selbst schnell proliferierende Krebszellen (KLN205) in der Lage, in Gegenwart dieser Inhibitoren ein konstantes Niveau an Gesamt-ATP aufrechtzuerhalten (ergänzende Abb. S4c, d), wobei sie vermutlich andere Nährstoffe wie Glutamin verwenden, anstatt die Glukoseaufnahme zu aktivieren. Wichtig ist, dass weder 3-PO noch Alizarin Rot S das F-Actin-Zytoskelett störten oder DSBs induzierten (Daten nicht gezeigt).

UM0112176 stört ALDOA-Actin-Interaktionen

Aldolase ist dafür bekannt, dass sie mit Actin und Actin-bindenden Proteinen8,9 interagiert und so die Dynamik des Cytoskeletts beeinflusst. Sie kann die WASP-abhängige Aktinpolymerisation14 hemmen und zu einem Zytokinese-Defekt20 führen, aber auch Aktin-abhängige Prozesse wie die bei der EMT-Transition21 erworbene Krebszellmotilität fördern. Diese komplexe Rolle von ALDOA ruft die Hypothese hervor, dass die Bindung von UM0112176 an ALDOA für die beobachtete Störung des F-Actin-Zytoskeletts verantwortlich sein könnte.

Die Störung des Zytoskeletts ist jedoch Aktin-Isoform-spezifisch, da UM0112176 die Assoziation von ALDOA mit der fibrillären Form des zytoskelettalen Aktins, das β- und γ-Isoformen enthält, teilweise störte (Abb. 3a), während es keinen Effekt auf die Stabilität der Muskel-Aktin-Polymere (α-Isomer) hatte (Daten nicht gezeigt). In den F-Aktin-Aldolase-Rafts finden sich F-Aktin-Kontakte mit der Aldolase hauptsächlich an zwei Stellen: in der Region der Reste 1-8 und der Reste 350-36522. Antigene Sonden lokalisierten enge Bindungsstellen für Aldolase in konservierten C-terminalen Regionen von α-Actin-Mikrofilamenten23. Eine Brownian-Dynamics-Simulation fand ähnliche Aktinreste, die an der Aldolase-Bindung beteiligt sind24. Da Unterschiede in den Resten 1-8 die Aktin-Isoformen unterscheiden25 , treibt die Aktin-N-terminale Region somit die isoformspezifische Bindung mit Aldolase an. Es wurde auch gezeigt, dass ALDOA in zellulären Pulldowns von Lungenkrebszelllysaten bevorzugt mit dem γ-Actin interagiert26 , was bestätigt, dass der Kontakt von ALDOA mit der Aktin-N-terminalen Region zwischen den Aktin-Isoformen unterscheidet.

Interessanterweise überschneidet sich die ALDOA-Bindungsstelle mit der Bindungsstelle von Cofilin auf Aktin27,28, einem Protein, von dem bekannt ist, dass es die Depolymerisation von Aktinfasern beschleunigt29, dessen Bindung überlappende N- und C-terminale Aktinreste impliziert30. In Anbetracht der großen globulären Formen von ALDOA und Cofilin deutet die umfangreiche scheinbare Überlappung der Aktin-Bindungsstellen auf eine Konkurrenz zwischen ALDOA und Cofilin um die gleichen Bindungsstellen auf Aktin hin. Die Inkubation von F-Actin (β-γ-Isoformen) sowohl mit ALDOA als auch mit Cofilin (in äquimolaren Untereinheitskonzentrationen) zeigte nur einen geringen Effekt von Cofilin auf die Stabilität von F-Actin (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass ALDOA F-Actin vor der Wirkung von Cofilin schützt. Dies ist konsistent mit der erwarteten engeren Bindung von ALDOA an F-Actin23 als Cofilin, das eine geschätzte Dissoziationskonstante von ∼10 μM31 hat. Der in vitro Schutz durch ALDOA gegen die Cofilin-vermittelte Depolymerisation von Aktin wurde durch die Zugabe von UM0112176 aufgehoben (Abb. 3b). Obwohl ALDOA in vitro mit Cofilin interagieren konnte, fanden wir keine Hinweise darauf, dass UM0112176 diese Interaktion stört (ergänzende Abb. S2b). Die Destabilisierung des F-Actin-Zytoskeletts durch UM0112176 muss also aus der Dissoziation von ALDOA von seinen Bindungsstellen auf F-Actin resultieren, die sich mit den Cofilin-Bindungsstellen überlappen, wodurch die Bindung von Cofilin an F-Actin ermöglicht und dessen Depolymerisation vermittelt wird. In Übereinstimmung damit beobachteten wir das Fehlen einer Kolokalisierung von zytoskelettalem Aktin und ALDOA in KLN205-Zellen, die mit UM0112176 behandelt wurden (Abb. 3c).

Um die Interaktion von UM0112176 mit ALDOA (PDB: 1ZAJ) zu untersuchen, wurde eine blinde molekulare Docking-Analyse durchgeführt. Berechnungen mit AutoDock32 ergaben 1 Haupt- und 2 Nebenposencluster für UM0112176 an ALDOA. Der Hauptcluster enthielt 17 Posen mit vorhergesagter Bindungsenergie nahe ∼9,2 kcal/Mol, während der Nebencluster jeweils 3 Posen mit etwas geringerer Bindungsenergie aufwies. Die visuelle Inspektion zeigt, dass die oberste Pose vicinal zu Lys-293 und Cys-338 liegt (Abb. 3d), so dass ihre Rotamere Wasserstoffbrückenbindungen mit den funktionellen Gruppen -C≡N und -Cl von UM0112176 eingehen können. Die Modifikation von Cys-72 und Cys-338 entweder durch ihre Vernetzung33 oder durch oxidiertes Glutathion hemmt die katalytische Aktivität34 durch eine Fernkommunikation mit dem ~25Å entfernten aktiven Zentrum. Die Hemmung dynamischer Ereignisse während der Katalyse, die für die ALDOA-Aktivität erforderlich sind, durch UM0112176 über große Entfernungen, wie sie für die Inaktivierung von ALDOA durch oxidiertes Glutathion gezeigt wurde34, steht im Einklang mit seiner Hemmungskinetik. Interessanterweise wurde gezeigt, dass Lys-293 die Interaktion von γ-Actin mit ALDOA fördert, da die K293A-Mutation die Bindung aufhebt26. Darüber hinaus überschneiden sich die Reste, die den UM0112176-Bindungshohlraum umfassen, mit denen, die für Raltegravir auf ALDOA gezeigt wurden, und die Behandlung mit Raltegravir (100 μM) verlängerte die Überlebensrate von Mäusen ∼2-fach relativ zur Kontrollgruppe26 in einem orthotopen Lungenkrebsmodell. Wir stellen die Hypothese auf, dass UM0112176 die Fähigkeit, ALDOA von β/γ-Aktin zu dissoziieren, ausnutzt, indem es mit γ-Aktin um die Interaktion mit Lys-293 auf ALDOA konkurriert.

Dieser Befund erklärt jedoch nicht das Fehlen einer Wirkung von UM0112176 auf zytoskelettales Aktin in normalen Zellen. Offensichtlich müssen in normalen Zellen andere Aktin-assoziierte Proteine das Zytoskelett vor der Cofilin-induzierten Depolymerisation schützen, aber in Krebszellen ist dieser Schutz offenbar defekt. Wir suchten daher nach krebsspezifischen Faktoren, die die Depolymerisation des F-Aktin-Zytoskeletts beschleunigen und die Apoptose induzieren können. Wir fanden heraus, dass einer der herausragenden zellulären Effekte der UM0112176-Applikation eine sehr schnelle Intensivierung der ROS-Produktion war, die ausschließlich in Krebszellen auftrat (Abb. 2a). Da der Anstieg der ROS-Werte mit der Modulation der F-Aktin-Faserstruktur35 einherging, konzentrierten wir uns auf Zytoskelett-assoziierte Quellen von ROS, die möglicherweise spezifisch für Krebszellen sind.

Erhöhung der ROS-Werte nach UM0112176-Behandlung wird hauptsächlich durch NOX-Aktivität verursacht

Die NADPH-abhängige Oxidase (NOX) ist eine bedeutende Quelle für intrazelluläre ROS, die durch das Aktin-Zytoskelett reguliert werden kann36. Es wurde nachgewiesen, dass NOX1 an der epithelial-mesenchymalen Transition beteiligt ist, einem Prozess, der die Invasion von Krebszellen erleichtert37. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die UM0112176-induzierte Verdrängung von ALDOA aus polymerisiertem Aktin eine Cofilin-gesteuerte Destabilisierung des Zytoskeletts ermöglicht und dass die darauf folgende Depolymerisation für den ROS-Anstieg verantwortlich sein könnte. Interessanterweise werden in den meisten Krebszellen die NOX-Proteine (insbesondere die NOX1-Isoform) auf einem höheren Niveau als in normalen Zellen exprimiert38 (ergänzende Abb. S2c). Daher haben wir die NOX1-Expression in Krebszellen zum Schweigen gebracht (Abb. 3h) oder die NOX1-Aktivität mit Apocynin39 gehemmt. Die daraus resultierende Reduktion der NOX1-Aktivität und -Expression blockierte die UM0112176-induzierte Erhöhung der ROS-Werte (Abb. 3e-g).

Dieser Aktin-abhängige Mechanismus der ROS-Produktion legt nahe, dass UM0112176 durch die Stimulierung der Verdrängung von ALDOA aus den Aktinfilamenten Cofilin in die Lage versetzt, Aktinfilamente zu depolymerisieren und damit NOX zu aktivieren. Die ROS-Produktion durch aktiviertes NOX ermöglicht wiederum die Redox-Aktivierung von Slingshot Homolog 1 zur Dephosphorylierung von P-Cofilin40. In der Tat reduzierte die Zugabe von UM0112176 die zellulären P-Cofilin-Spiegel (ergänzende Abb. S5a). ALDOA, das durch die Wirkung von UM0112176 von Aktinfilamenten dissoziiert wird, fördert deren weitere Depolymerisation, indem es zusätzliche Bindungsstellen für dephosphoryliertes Cofilin freisetzt, das sich mit den Filamenten verbindet. Dieser Feed-Forward-Mechanismus würde die schnelle Depolymerisation von Aktin erklären, die in KLN205- und hNSCLC-Zellen beobachtet wurde.

Überraschenderweise stoppte Apocynin den UM0112176-induzierten Anstieg des zytoplasmatischen Kalziumspiegels nur teilweise und es schützte nicht vor der Aktivierung von Caspase 3 (Abb. 3i, j). Obwohl Apocynin offenbar die Störung der Aktinfilamente durch UM0112176 hemmte, erschien das Zytoskelett im Vergleich zu unbehandelten Zellen stärker gebündelt, und die Zellen zeigten eine veränderte Morphologie, wenn sie gleichzeitig mit Apocynin und UM0112176 behandelt wurden (Abb. 3k). Die Störung des Zytoskeletts entweder durch UM0112176 oder in Kombination mit Apocynin ist konsistent mit der NOX1-abhängigen ROS-Produktion für die korrekte Organisation des Zytoskeletts in diesen Krebszellen.

Zellulärer Mechanismus der UM0112176-Wirkung beinhaltet die Öffnung von mitoKATP

Ein Protein, das möglicherweise das Aktin-Zytoskelett mit der mitochondrialen ROS-Produktion und Apoptose verbindet, ist der mitochondriale ATP-abhängige Kaliumkanal (mitoKATP). Eine Verbindung zwischen intrazellulärer K+-Konzentration und Apoptose wurde in vielen Systemen dokumentiert und hat mitoKATP41 impliziert. Der Kanal scheint empfindlich auf die Depolymerisation von Aktin zu reagieren, die seine Öffnung erhöht42,43 und zu einer leichten Entkopplung und Erhöhung der mitochondrialen ROS-Produktion führt44. In der Literatur gibt es jedoch eine Kontroverse, wobei einige Ergebnisse darauf hindeuten, dass eher die Aktin-Depolymerisation den mitoKATP verschließt45.

Wir behandelten die Krebszellen mit 5HD (5-Hydroxydecanoat) vor, von dem bekannt ist, dass es die Öffnung des mitoKATP blockiert44, und wir beobachteten, dass 5HD den UM0112176-induzierten Anstieg der ROS deutlich verringerte (Abb. 4a). Die 5HD-Vorbehandlung war nicht in der Lage, die Störung des Aktin-Zytoskeletts (Abb. 4b) und die Induktion der Apoptose durch UM0112176 zu blockieren, obwohl sie die Rate der Caspase 3-Aktivierung signifikant verlangsamte (Abb. 4c). Somit könnte die UM0112176-getriebene Depolymerisation des Zytoskelett-Aktins für die ROS-Produktion sowohl durch die Öffnung des mitoKATP als auch unabhängig davon durch die NOX1-Aktivierung verantwortlich sein, die wiederum die Störung des Zytoskeletts potenziert.

Der umgekehrte Modus des Natrium-Kalzium-Austauschers ist für den UM0112176-induzierten Kalziumeinstrom verantwortlich

Die Bindung von UM0112176 an ALDOA war auch mit einem signifikanten Anstieg des zellulären Kalziumspiegels in Krebszellen, nicht aber in normalen Zellen verbunden (Abb. 2b). Dieser Anstieg war in KLN205 (<5 min) schneller als in hNSCLC-Zellen (~20 min) (Abb. S4g). Wir suchten daher nach dem Ursprung dieses Calciums und fanden, dass es aus dem extrazellulären Speicher stammt (Abb. 4d, e). Die Abreicherung von Ca2+ aus dem Kulturmedium verhinderte den UM0112176-induzierten Anstieg des zellulären Kalziums.

Wir fragten dann, ob NOX1 und mitoKATP die Veränderungen des intrazellulären freien Ca2+-Spiegels synergistisch regulieren könnten. In der Tat schützte die Hemmung von NOX1 teilweise vor dem UM0112176-induzierten Ca2+-Anstieg (Abb. 3i), während die Hemmung der mitoKATP-Öffnung den Anstieg praktisch aufhob (Abb. 4f, g). Da keines der beiden Proteine als Kalziumkanal oder -austauscher fungiert, müssen sie als Regulatoren (z. B. über ROS) von Proteinen wirken, die direkt an der Kalziumhomöostase beteiligt sind.

Die Aktivierung von NOX kann zur mitoKATP-Öffnung führen, die wiederum indirekt den umgekehrten Modus des Natrium-Kalzium-Austauschers (NCXrev) stimulieren kann, wodurch der Einstrom von Ca2+ in die Zellen gefördert wird46. Daher testeten wir eine mögliche Beteiligung von NCX an dem UM0112176-induzierten Anstieg von Kalzium. In der Tat reduzierte die Hemmung des NCXrev durch KB-R794346 den Kalziumeinstrom (Abb. 4h). Dies verhinderte jedoch nicht die Induktion der Apoptose (ergänzende Abb. S5b).

Es wurde gezeigt, dass die Aktin-Depolymerisation die NCXrev-Aktivität stimuliert47 , was eine weitere Unterstützung für NCX als den für den Ca2+-Einstrom verantwortlichen Austauscher bei Zugabe von UM0112176 darstellt.

Daher kann gefolgert werden, dass der Crosstalk zwischen NOX und mitochondrialen ROS48 über die Stimulation der ROS-sensitiven MAPK-Kaskade Membrantransporter, Natrium/Wasserstoff-Austauscher und Natrium/Bikarbonat-Cotransporter aktiviert und in einem Ca2+-Einstrom über NCXrev49 kulminiert. Darüber hinaus aktiviert eine zytoplasmatische Ca2+ -Überladung NOX50 und die mitochondriale Ca2+ -Beladung über den mitochondrialen Calcium-Uniporter beschleunigt die mitochondriale ROS-Produktion51 , wodurch eine positive Rückkopplungsschleife entsteht, die hohe ROS- und Calcium-Spiegel aufrechterhält und die Apoptose induziert. Die Unterdrückung des Ca2+-Einstroms durch Hemmung des NCXrev (Abb. 4h) unterstützt die Vorstellung, dass die Öffnung von mitoKATP, die zur Freisetzung von mitoROS in das Zytoplasma führt52 , das entscheidende Ereignis für die Apoptose darstellt.

Krebszell-spezifische Abnahme des ATP-Spiegels nach ALDOA-Hemmung induziert eine schnelle Dissoziation von HK2 aus den Mitochondrien

Obwohl UM0112176 die ATP-Synthese in allen Zelllinien hemmte, waren die ATP-Änderungen größer und schneller in Krebszellen (Abb. 2c). Wichtig ist, dass diese Veränderungen bei normalen Zellen, nicht aber bei Krebszellen, nach Absetzen des Inhibitors reversibel waren (ergänzende Abb. S4e). Die Zugabe von UM0112176 induzierte einen schnellen Abfall (<5 min) des ATP-Spiegels in KLN205 (∼40% Abnahme) und hNSCLC (∼20% Abnahme) Zellen (Ergänzende Abb. S4f), während in normalen Zellen keine derartigen Veränderungen beobachtet wurden (ergänzende Abb. S4f).

Diese biphasische Kinetik des UM0112176-induzierten ATP-Abbaus warf die Frage nach dem Mechanismus auf, der für die schnelle Abnahme des ATP-Spiegels in Krebszellen verantwortlich ist. Daher untersuchten wir die subzelluläre Lokalisation der Hexokinase 2 (HK2), deren Expression in den meisten Krebszellen erhöht ist und die für ihre volle Aktivität und effiziente ATP-Synthese durch die Mitochondrien eine Assoziation mit den Mitochondrien benötigt4,5. Wir beobachteten, dass sich HK2 in Krebszellen, aber nicht in normalen Zellen, nach der Behandlung mit UM0112176 schnell von den Mitochondrien löste (Abb. 4i), und die Zeitspanne dieser Veränderungen korrelierte mit der Zeitskala der ROS-Produktion. Somit korreliert in schnell proliferierenden Krebszellen die erste Phase der UM0112176-abhängigen Abnahme des ATP-Spiegels mit der schnellen Dissoziation von HK2 aus den Mitochondrien.

Das Silencing der ALDOA-Expression (ergänzende Abb. S5c) rekapitulierte die durch die UM0112176-Behandlung induzierten Beobachtungen (ergänzende Abb. S5d-f) und zeigte keine begleitende Abnahme des ATP-Spiegels, was mit den Ergebnissen von Lew und Tolan14,20 übereinstimmt. Dies spricht dafür, dass die beobachtete Abnahme des ATP-Spiegels nicht die Folge einer geringeren Stoffwechselaktivität ist, sondern von „moonlighting“-Interaktionen von ALDOA mit seinen Bindungspartnern herrührt, die durch UM0112176 aufgehoben werden. Chang et al. wiesen darauf hin, dass die ALDOA-Mutation K293A die Interaktion von ALDOA mit γ-Actin beeinflusst, aber keine Veränderungen des glykolytischen Flusses nach sich zieht26 , was unsere Interpretation unterstützt, dass UM0112176 die Moonlighting-Interaktionen von ALDOA stört.

Die Wirkung von UM0112176 auf Krebszellen kann nicht durch FBP-Akkumulation erklärt werden

Um zu überprüfen, ob die beobachteten Veränderungen mit der nicht-metabolischen Funktion von ALDOA zusammenhängen oder ob sie Folgen der Hemmung der Enzymaktivität und damit der Akkumulation von FBP waren, untersuchten wir die Wirkung von FBP auf den ROS- und ATP-Spiegel sowie auf die Zytoskelettstruktur. Obwohl die Effizienz der Transmembrandiffusion von FBP relativ gering ist, kann es von einer Vielzahl von Zellen aktiv und effektiv transportiert werden53,54. Wir beobachteten, dass 20 mM, aber nicht 5 mM extrazelluläres FBP die ROS-Produktion stimulierte und die Zytoskelettstruktur in Krebszellen destabilisierte (ergänzende Abb. S3c, d), was mit der Langstreckenkommunikation zwischen der aktiven Stelle der Aldolase und dem UM0112176-Bindungsort vereinbar ist. Die gleichen FBP-Konzentrationen hatten nur einen geringen Effekt auf normale Zellen (ergänzende Abb. S3c, d), was den Trend widerspiegelt, der bei der zellulären Behandlung mit UM0112176 beobachtet wurde. Das Fehlen erkennbarer Veränderungen in Astrozyten stimmt mit dem weitgehenden Fehlen von NOX1 in diesen Zellen überein (ergänzende Abb. S2c) und unterstreicht die Bedeutung der ROS-Produktion durch NOX1 in Krebszellen für die richtige Organisation des Zytoskeletts. Obwohl das Vorhandensein niedriger NOX1-Konzentrationen in normalen Zellen, die bei Behandlung mit UM0112176 keine Apoptose erleiden, dagegen sprechen könnte, dass NOX1 während der UM0112176-Behandlung Krebszellen Selektivität verleiht, wurde gezeigt, dass Kulturmedien mit niedrigem Glukosegehalt (5 mM) die NOX4-Isoform daran hinderten, sich in Lipid Rafts in Adipozyten zu orientieren und sie in einer Membranfraktion mit niedriger Aktivität zu halten55. Da unsere Zellkulturexperimente mit Glukosekonzentrationen durchgeführt wurden, die der physiologischen Umgebung entsprechen (5 mM), dient das Vorhandensein von NOX1 in normalen Zellen wahrscheinlich einer anderen, nicht-zytoskelettalen Funktion.

UM0112176 verhindert die nukleäre Lokalisierung von ALDOA

Unerwartet führte die Behandlung mit UM0112176 auch zu einer Abreicherung von ALDOA aus den Kernen von Krebszellen (ergänzende Abb. S5g). Es wurde gezeigt, dass die Lokalisierung von ALDOA im Zellkern mit der Progression des Zellzyklus verbunden ist17. Der Mechanismus des ALDOA-Kerntransports und seine Bedeutung für die Regulierung des Zellzyklus erfordert jedoch weitere Untersuchungen.