Die Ultraviolett-Visuelle (UV-Vis) Spektroskopie ist eine der beliebtesten Analysetechniken im Labor.
Bei der UV-Vis Spektroskopie wird Licht bei einer bestimmten Wellenlänge im UV- oder sichtbaren Spektrum durch eine Probe geleitet. Wenn die Probe einen Teil des Lichts absorbiert, wird nicht das gesamte Licht durchgelassen bzw. transmittiert. Die Transmission ist das Verhältnis der Intensität des durchgelassenen Lichts zum einfallenden Licht und ist mit der Extinktion korreliert. Die Extinktion kann quantitativ verwendet werden, um die Konzentration einer Probe zu bestimmen. Sie kann auch qualitativ verwendet werden, um eine Verbindung zu identifizieren, indem die gemessene Absorption über einen Bereich von Wellenlängen, das so genannte Absorptionsspektrum, mit den veröffentlichten Daten verglichen wird. In diesem Video wird die UV-Vis-Spektroskopie vorgestellt und ihre Anwendung im Labor bei der Bestimmung der Probenkonzentration und der Reaktionskinetik demonstriert.
Wenn ein Photon auf ein Molekül trifft und absorbiert wird, wird das Molekül von seinem Grundzustand in einen Zustand höherer Energie versetzt. Die Energiedifferenz zwischen beiden ist die Bandlücke. Die Energie des Photons muss genau mit der Bandlücke übereinstimmen, damit das Photon absorbiert werden kann. Die chemische Struktur bestimmt die Bandlücke; daher hat jedes Molekül ein einzigartiges Absorptionsspektrum.
Die Absorption folgt dem Beerschen Gesetz, das besagt, dass die Absorption gleich dem molaren Schwächungskoeffizienten mal der Weglänge und der Konzentration ist. Der molare Abschwächungskoeffizient bezieht sich auf die Fähigkeit der einzelnen Verbindung, Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren. Die Weglänge bezieht sich auf die Strecke, die das Licht durch die Probe zurücklegt, was bei Standardküvetten typischerweise 1 cm beträgt. Das Beersche Gesetz kann zur Berechnung der Probenkonzentration verwendet werden, wenn das Absorptionsvermögen bekannt ist, oder es kann eine Kalibrierungskurve verwendet werden.
UV-Vis wird oft als eine allgemeine Technik bezeichnet, da die meisten Moleküle Licht im UV-visuellen Wellenlängenbereich absorbieren. Der UV-Bereich erstreckt sich von 100-400 nm, das sichtbare Spektrum reicht von 400-700 nm. Die meisten Spektralphotometer arbeiten jedoch nicht im tiefen UV-Bereich von 100-200 nm, da Lichtquellen in diesem Bereich teuer sind. Die meisten UV-Vis-Spektralphotometer verwenden für den UV-Bereich eine Deuteriumlampe, die Licht von 170-375 nm erzeugt, und für den sichtbaren Bereich eine Wolframglühlampe, die Licht von 350-2.500 nm erzeugt.
Da die Lichtquelle in der Regel eine Lampe mit breiten Wellenlängenbereichen ist, wird die spezifische Absorptionswellenlänge mit Hilfe von Filtern oder einem Monochromator ausgewählt. Ein Monochromator ist ein Gerät, das die Wellenlängen des Lichts räumlich trennt und dann einen Ausgangsspalt dort platziert, wo die gewünschte Wellenlänge des Lichts ist. Der Monochromator kann über einen Wellenlängenbereich gescannt werden, um ein vollständiges Absorptionsspektrum zu erhalten. Dies macht die Technik nützlich für die Quantifizierung und Identifizierung einer breiten Palette von Molekülen.
Nachdem nun die Grundlagen der UV-Vis-Spektroskopie erläutert wurden, wollen wir einen Blick auf ein einfaches UV-Vis-Experiment im Labor werfen.
Bevor Sie mit der Messung beginnen, schalten Sie das Spektralphotometer ein und lassen Sie die Lampen eine angemessene Zeit lang aufwärmen, um sie zu stabilisieren.
Bereiten Sie eine Leerwertküvette vor, indem Sie eine saubere Küvette mit dem Probenlösungsmittel füllen und dann die Außenseite mit fusselfreiem Papier abwischen, um eventuelle Fingerabdrücke zu entfernen.
Stellen Sie sicher, dass die Küvette richtig ausgerichtet ist, so dass die gerillten Seiten nicht in den Strahlengang fallen, und setzen Sie sie in das Spektralphotometer ein. Verschließen Sie den Deckel, um zu verhindern, dass Umgebungslicht in das System eindringt.
Messen Sie die Extinktion des Leerwertes bei einer Wellenlänge oder über einen Wellenlängenbereich. Notieren oder speichern Sie die Extinktion, da sie von der Extinktion der Probe subtrahiert werden muss.
Nächstes Mal verwerfen Sie den Leerwert und spülen die Küvette zweimal mit Probe. Füllen Sie dann die Küvette etwa ¾ mit Probe. Wischen Sie die Außenseite der Küvette erneut ab, um sicherzustellen, dass sie sauber und frei von Fingerabdrücken ist.
Setzen Sie die Küvette in der richtigen Ausrichtung in das Spektralphotometer ein und befestigen Sie den Deckel.
Erfassen Sie eine Extinktionsmessung oder ein Spektrum bei der gleichen Wellenlänge oder dem gleichen Wellenlängenbereich wie die Blindprobe. Subtrahieren Sie das Leerspektrum oder die Leerwertmessung, falls das Gerät dies nicht automatisch tut.
Bestimmen Sie aus dem aufgenommenen Absorptionsspektrum das Absorptionsmaximum oder λmax.
Um die Menge des Analyten in der Probe zu quantifizieren, erstellen Sie eine Kalibrierkurve unter Verwendung eines Bereichs bekannter Analytkonzentrationen. Weitere Informationen zur Erstellung und Verwendung einer Kalibrierkurve finden Sie im Video „Kalibrierkurven“ dieser Sammlung.
Die Absorptionsmessung kann auch zur Berechnung der Reaktionskinetik verwendet werden, indem die Zunahme oder Abnahme der Konzentration einer Verbindung während der Reaktion gemessen wird. Beginnen Sie mit einer ersten Messung der Probe, in diesem Fall des blauen Farbstoffs, bei dem Absorptionsmaximum vor der Reaktion.
Nächstens geben Sie schnell das Reagenz, in diesem Fall Bleichmittel, hinzu, um die chemische Reaktion zu starten. Rühren Sie es gut um, so dass es sich mit der Probe vermischt.
Messen Sie die Absorption am Absorptionsmaximum im Laufe der Zeit.
Das anfängliche Absorptionsspektrum der blauen Farbstoffprobe ist dargestellt. Die Hintergrundfarben zeigen die Farben des Lichts im sichtbaren Spektrum. Der blaue Farbstoff hat ein Absorptionsmaximum bei etwa 630 nm.
Die Kinetik der Reaktion zwischen blauem Farbstoff und Bleichmittel wurde über die Zeit gemessen. Die Absorption des blauen Farbstoffs nimmt mit der Zeit ab, da er mit dem Bleichmittel reagiert. Die Absorption erreicht nach 300 s nahezu Null, was anzeigt, dass die Reaktion nahezu abgeschlossen ist. Für weitere Informationen über Kinetik und Reaktionen sehen Sie sich bitte das JoVE Science Education Video „Reaction Rate Laws“ an.
Die UV-Vis-Spektroskopie wird in vielen verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt, um eine Probe zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Zum Beispiel wird die UV-Vis-Spektroskopie häufig in biologischen Bereichen eingesetzt, um die Menge an Protein in einer Probe zu quantifizieren. Zur Quantifizierung von Proteinen wird häufig ein Bradford-Assay mit Hilfe eines Farbstoffs verwendet. Zunächst wird eine Kalibrierungskurve mit bekannten Proteinkonzentrationen erstellt, typischerweise mit Rinderserumalbumin (BSA). Dann wird den Standards und der Probe jeweils ein Coomassie-Blau-Farbstoff zugesetzt. Die Absorption des Protein-Farbstoff-Komplexes wird dann bei 595 nm gemessen.
Alternativ können Proteine auch direkt über ihre Absorption bei 280 nm gemessen werden. In diesem Beispiel wird die Proteinkonzentration mit einem Ultra-Low-Volume-Spektrophotometer quantifiziert. Für viele Proteine entspricht eine Absorption von 1 einer Konzentration von 1 mg/mL.
Die UV-Vis-Spektroskopie wird auch zur Quantifizierung der Menge an Bakterienzellen in einer Zellkultur verwendet. Bei dieser Messung wird die Absorption oder die optische Dichte bei 600 nm gemessen. Typischerweise zeigt eine OD600-Messung von 1 die Anwesenheit von 8 x 108 Bakterienzellen pro mL an. Die Messung der Zelldichte während des Kulturwachstums ermöglicht die Bestimmung der bakteriellen Wachstumskurve und kann dabei helfen, zu erkennen, wann sich eine Kultur in der exponentiellen Wachstumsphase befindet.
Stickstoffoxid und Stickstoffdioxid, oder NOx, ist ein Nebenprodukt von Autoabgasen und kann schädlich für die Umwelt sein, da es schädliches troposphärisches Ozon bildet. NOx kann gemessen werden, indem man es mit einer Lösung aus Sulfanilsäure und Naphthyl-Ethylendiamin umsetzt. Die resultierende Lösung ist ein rosa gefärbtes Azofarbstoffmolekül, dessen Intensität direkt mit der NOx-Konzentration korreliert ist. Diese Konzentration kann dann mit einem UV-Vis-Spektralphotometer bestimmt werden.
Sie haben gerade die Einführung in die UV-Vis-Spektroskopie von JoVE gesehen. Sie sollten jetzt die Grundlagen des UV-Vis-Betriebs verstehen, wie man eine Probe mit einem UV-Vis misst und wie man die Absorption mit der Probenkonzentration korreliert.
Danke fürs Zuschauen!