Western Blot

Western Blot (WB) ist eine gängige Methode zum Nachweis und zur Analyse von Proteinen. Sie basiert auf einer Technik, bei der die durch Elektrophorese aufgetrennten Proteine vom Gel auf eine Membran übertragen werden, wo sie spezifisch sichtbar gemacht werden können (auch Blotting genannt). Das Verfahren wurde erstmals 1979 von H. Towbin et al beschrieben (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979) und zwei Jahre später von W. Neal Burnette benannt (Burnette, 1981). Towbin et al. beschrieben den elektrophoretischen Transfer von Proteinen aus Polyacrylamidgelen auf Nitrocelluloseblätter, wobei das ursprüngliche Gelmuster exakt erhalten wurde. Der Aufbau besteht aus einem Standardsatz von sieben Schritten, Abbildung 1.

Abbildung 1. Die Standardschritte beim Western Blotting.

Proben werden vorbereitet und auf ein Gel geladen und während der Elektrophorese bewegen sich die negativ geladenen Proteine in Richtung der positiv geladenen Anode. Um die Proteine weiter zu analysieren, werden sie in einem Blotting genannten Verfahren auf eine Membran übertragen. Nach dem Transfer wird die Membran blockiert, um in den folgenden Schritten unerwünschte Membran-Protein-Wechselwirkungen zu verhindern. Zur Visualisierung des interessierenden Proteins wird die Membran in der Regel zunächst mit einem primären protein-spezifischen Antikörper und anschließend mit einem markierten sekundären Antikörper zur Detektion sondiert. Von der Membran wird ein Bild aufgenommen und das Ergebnis analysiert.

Durch Zugabe einer separaten Markerlösung in eine der Vertiefungen des Gels ist es möglich, neben den Antikörperinteraktionen, die zum Nachweis des spezifischen Proteins verwendet werden, auch die Größe des Proteins abzuschätzen. Die Auftrennung auf dem Gel ist nicht nur größenbedingt, sondern in gewissem Maße auch abhängig von der molekularen Ladung, den hydrophoben Bereichen und dem Denaturierungsgrad. Der Aufbau des Experiments kann in vielerlei Hinsicht variiert werden, um der spezifischen Anfrage am besten gerecht zu werden. Bei der Analyse der Ergebnisse müssen Variationen zwischen den Lanes hinsichtlich der Beladung und der Transferraten zwischen den Blots berücksichtigt werden. Darüber hinaus ist die nichtlineare Beziehung des erzeugten Signals über den Konzentrationsbereich der Proben ebenfalls ein Aspekt, der bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden muss. Das Ergebnis eines WB-Experiments hängt von drei wichtigen Faktoren ab: der Fähigkeit des Antikörpers, ein spezifisches Protein zu binden, der Stärke der Interaktion und der Konzentration des interessierenden Proteins selbst. Darüber hinaus sind die Spezifität der Bindung an das Target und eine geringe Kreuzreaktivität ebenfalls wichtige Merkmale. Das Ergebnis der WB ist nicht immer einfach zu interpretieren, da die Größe des Proteins aufgrund von posttranslationalen Modifikationen, wie z. B. Glykosylierung, oder Interaktionen mit anderen Proteinen von der theoretischen Masse abweichen kann. Dennoch ist die WB eine sehr verbreitete Methode und fast alle verfügbaren kommerziellen Antikörper wurden mit dieser Methode validiert.

Technik

Probenvorbereitung

Der erste Schritt einer WB ist die Vorbereitung der zu analysierenden Probe, z. B. Gewebe, Zellen oder eine andere Lösung. Normalerweise muss das Gewebe durch Mischen, Homogenisieren oder Sonikation aufgeschlossen werden. Es werden Puffer hinzugefügt, um die Zellen zu lysieren und die Proteine zu solubilisieren, und oft wird ein Inhibitor hinzugefügt, um eine Denaturierung oder einen Abbau zu verhindern. Zur weiteren Aufbereitung der Proben werden verschiedene Filtrations- und Zentrifugationsmethoden angewendet. Es ist wichtig, die Gesamtproteinkonzentration des erzeugten Extrakts zu bestimmen, um eine bestimmte Menge auf das Gel laden zu können, um einen Vergleich zwischen den Proben zu ermöglichen. Üblicherweise wird ein biochemischer Assay verwendet, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Der Extrakt wird dann mit Ladepuffer verdünnt, der aus Glycerin und einem Farbstoff (z. B. Bromphenolblau) besteht. Das Glycerin dient zur Vereinfachung der Beladung durch Erhöhung der Dichte des Extrakts und der Farbstoff wird zur Visualisierung der Probe zugegeben. Hitze wird auf die Proben angewendet, um die Strukturen des Proteins aufzubrechen, was dazu beiträgt, dass die negative Ladung nicht neutralisiert wird (Mahmood & Yang, 2012). Vorzugsweise werden Positiv- und Negativkontrollen in das Set-up aufgenommen, um die Identität des Proteins sowie die Aktivität des Antikörpers zu bestätigen.

Gelelektrophorese

Nach der Probenvorbereitung kann der Extrakt geladen werden, um die Proteine durch Gelelektrophorese nach Größe zu trennen. Über das Gel wird ein elektrisches Feld angelegt, das die geladenen Moleküle in Bewegung versetzt. In der WB werden Polyacrylamidgele für die Proteintrennung verwendet und die Methode wird daher Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) genannt, wenn native Bedingungen verwendet werden. Bei denaturierenden Bedingungen wird Natriumdodecylsulfat (SDS) zugegeben und die Methode wird daher SDS-PAGE genannt. Das SDS bindet an das Protein und bildet unabhängig von der Eigenladung eine negativ geladene Mizelle um das Protein. Durch die Denaturierungsbedingung wird die dreidimensionale Struktur der Proteine aufgelöst und die Ladung des Proteins wird relativ zu seiner Größe, was zu einer Trennung der Proteine nur nach Größe führt. Bei Verwendung nativer Bedingungen ist die Mobilität sowohl von der Ladung als auch von der hydrodynamischen Größe abhängig, was den Nachweis von Ladungsänderungen aufgrund von chemischem Abbau, Konformationsänderungen aufgrund von Faltung oder Entfaltung, Aggregation oder anderen Bindungsereignissen ermöglicht.

Das Gel besteht typischerweise aus zwei Abschnitten mit unterschiedlichen Dichten: (i) einem Stapelgel und (ii) einem Trenngel (Abbildung 2). Die Unterschiede zwischen den beiden Abschnitten liegen im pH-Wert und in der Gelkonzentration. Bei einem etwas sauren pH-Wert und einer niedrigeren Acrylamid-Konzentration trennt das Stapelgel die Proteine schlecht, erlaubt ihnen aber, hochdefinierte scharfe Banden zu bilden, bevor sie in das Trenngel gelangen. Bei basischeren Bedingungen und höherer Gelkonzentration führt das Trenngel zu einer Differenzierung der Proteine nach Größe, da kleinere Proteine schneller im Gel wandern als größere. Vorgefertigte Gele sind praktisch; es ist jedoch auch möglich, sie von Hand zu gießen. Das Gel wird in Puffer getaucht und die Proteinproben und Marker werden in die Vertiefungen des Gels geladen. Eine Spannung wird an das Gel angelegt und die Proteine beginnen aufgrund ihrer negativen elektrischen Ladung, das Gel hinunter zu wandern. Die Wahl der richtigen Spannung ist wichtig, da eine zu hohe Spannung das Gel überhitzt und die Banden möglicherweise deformiert.

Abbildung 2. Ein typisches, in Puffer getauchtes Gel.

Blotting auf Membran

Nach der Gelelektrophorese werden die Proteine auf eine feste Trägermembran übertragen, was der dritte Schritt des Western Blot ist. Beim Transferprozess wird Spannung angelegt, um die Proteine vom Gel auf die Membran zu übertragen. Der Aufbau umfasst Schwämme, Filterpapiere, das Gel und die Membran, die zwischen dem Gel und der positiven Elektrode platziert wird, Abbildung 3. Dadurch wird die Migration der negativ geladenen Proteine vom Gel zur Membran sichergestellt. Es gibt drei Arten von Membranen: Nitrocellulose, Polyvinylidendifluorid (PVDF) und Nylon. Obwohl Nylonmembranen in mehreren Aspekten überlegen sind, ist dieser Membrantyp aufgrund der hohen Hintergrundbindung und der irreversiblen Anfärbung einiger Farbstoffe weniger verbreitet als die beiden anderen Alternativen. Der Hauptvorteil von Nitrocellulose-Membranen ist der niedrige Hintergrund unabhängig von der Detektionsmethode. Aufgrund einer relativ großen durchschnittlichen Porengröße sollten Nitrocellulosemembranen nicht für den Transfer von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht verwendet werden. Außerdem wird die Membran im trockenen Zustand spröde, was ihre Handhabung erschwert. Die stabilere PVDF-Membran erlaubt eine erneute Markierung und ist bequemer zu lagern. Die hydrophobe Beschaffenheit von PVDF führt zu einer hohen Proteinbindungskapazität, allerdings ist als Konsequenz auch der Hintergrund höher.

Abbildung 3. Die Proteine im Gel werden auf eine Membran geblottet und die Probe wird durch Blockieren, Zugabe von Antikörpern und Waschen nach einem bestimmten Schema visualisiert.

Es gibt zwei Methoden für das Blotting, die nass und halbtrocken genannt werden. Die nassen Bedingungen werden bevorzugt, wenn der Transfer effizient sein muss und eine hohe Qualität hinsichtlich deutlicher und scharfer Banden liefern soll. Außerdem ist dies die bessere Wahl für den Transfer von größeren Proteinkomplexen. Das Gel, die Membran und die Filterpapiere sind während des Transfers vollständig in den Puffer eingetaucht und es besteht keine Gefahr, dass das Gel austrocknet. Das Semi-Dry-Blotting ist schneller und es wird weniger Puffervolumen benötigt. Allerdings ist diese Transfermethode in der Regel weniger effizient, insbesondere bei größeren Proteinen, und es besteht die Gefahr der Überhitzung und Austrocknung des Gels bei längeren Transferzeiten.

Antikörper-Sondierung

Der vierte Schritt des WB ist die Antikörper-Sondierung. Um zu verhindern, dass die Antikörper unspezifisch an die Membran und nicht spezifisch an das interessierende Protein binden, wird eine Substanz verwendet, die die verbleibenden Stellen auf der Membran blockiert. Häufig verwendete Substanzen sind getrocknete fettfreie Milch, 5%iges Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt in Tris Buffered Saline Tween (TBST), normales Ziegenserum, Kasein oder Fischgelatine (Mahmood & Yang, 2012). Milch ist leicht zu beschaffen und preiswert, aber nicht für alle Nachweisetiketten geeignet. Fischgelatine ergibt einen geringeren Hintergrund, kann aber einige Proteine maskieren und ist zudem ein relativ teurer Blocking-Puffer. BSA ist preiswert, während Serum Immunglobuline enthalten kann, die zu Kreuzreaktivität führen. Die sorgfältige Auswahl des Blockierungsmittels ist entscheidend, da keiner der Blockierungspuffer für alle unterschiedlichen Antigen-Antikörper-Interaktionen ideal ist. Die Blockierungsprozedur besteht aus der Inkubation der Membran in dem entsprechenden Blockierungspuffer für eine Stunde oder länger. Bei langen Inkubationszeiten sollte die Blockierung bei +4°C durchgeführt werden, um das Risiko von Färbungsartefakten oder Hintergrund auszuschließen. Die Blockierung ist ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Reduzierung des Hintergrunds, ohne das Signal des interessierenden Proteins zu verringern.

Die blockierte Membran wird anschließend mit dem primären Antikörper inkubiert. Der Antikörper wird auf eine geeignete Konzentration in TBST, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Waschpuffer verdünnt. Es wird bevorzugt, den Antikörper mit BSA zu inkubieren, wenn der Antikörper wiederverwendet werden soll. Nach dem Waschen der Membran wird die Membran mit dem sekundären Antikörper inkubiert, der an den primären Antikörper bindet. Der sekundäre Antikörper ist mit einem Reporter markiert. Bei der Verwendung eines polyklonalen Antikörpers als Sekundärantikörper kann es zu einem gewissen Hintergrund kommen. Im Falle einer Hintergrundfärbung kann der sekundäre Antikörper mit einem nicht-immunen Serum des Wirts, in dem er erzeugt wurde, vorgeblockt werden. Eine Optimierung der Konzentration des sekundären Antikörpers ist aufgrund der recht großen Variationen zwischen den Antikörpern sowie dem verwendeten Detektionssystem zu empfehlen.

Detektion

Im fünften Schritt einer WB wird der Protein-Antikörper-Antikörper-Komplex auf der Membran detektiert. Es gibt verschiedene Arten der Markierung des sekundären Antikörpers, z. B. Enzyme, Fluorophore, Biotinylierung, Goldkonjugation und Radioisotope, wie in Abbildung 4 beispielhaft dargestellt. Unter den Enzymen wird am häufigsten HRP zusammen mit chemilumineszierenden, chemifluoreszierenden oder chromogenen Substanzen verwendet. HRP hat eine hohe Substratspezifität, die einen geringen Hintergrund ergibt, ist stabil und kostengünstig. Bei der Chemilumineszenz katalysiert das HRP-Enzym die Oxidation von Luminol aus dem Luminol-Peroxid-Detektionsreagenz. Die mehrstufige Reaktion erzeugt eine Lichtemission. Bestimmte Chemikalien wie Phenole können das emittierte Licht verstärken. Eine direkte Methode ist die Verwendung von Fluoreszenz; die Fluorophore emittieren Licht, nachdem sie angeregt wurden, und es wird kein Detektionsmittel benötigt. Sie eignet sich gut für den quantitativen Western und da verschiedene Fluorophore Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren, ist es möglich, Multiplexing und den spezifischen Nachweis von mehr als einem Protein gleichzeitig durchzuführen. Die Verwendung einer Chemikalie und/oder eines Enzyms zur Induktion der Erzeugung eines aktiven Fluorophors aus einem fluorogenen Substrat wird als Chemifluoreszenz bezeichnet. Zur weiteren Verstärkung der Signalintensität kann ein zweistufiges Biotin-Streptavidin-basiertes System verwendet werden. Die Goldkonjugation ist ebenfalls eine Methode, bei der sich Proteine durch die Anreicherung von Gold dunkelrot färben. Es ist auch möglich, Radioisotope zu verwenden, aber sie erfordern eine spezielle Handhabung und sind recht teuer.

Abbildung 4. Verschiedene Reportersysteme.

Bildgebung

Die Bildgebung ist der sechste Schritt der WB und die Erfassung kann analog mit einem Film oder digital mit einer CCD-Kamera oder einem Scanner erfolgen, der die verschiedenen Arten von emittierten Signalen erfasst. Das CCD-Imaging-Gerät ermöglicht eine Quantifizierung mit hoher Nachweisempfindlichkeit und einem breiten linearen Bereich, ohne dass Chemikalien verschwendet werden oder eine Dunkelkammer erforderlich ist. Es kann zur Detektion von Membranen, gefärbten Gelen oder für Anwendungen mit ultraviolettem Licht verwendet werden.

Analyse

Der letzte Schritt eines WB ist die Analyse der Ergebnisse. In einer typischen qualitativen Anwendung wird das Vorhandensein eines interessierenden Proteins bestätigt, die Menge durch visuelle Inspektion angenähert und die Größe durch Vergleich mit einem Marker bestimmt. Verbesserungen und Entwicklungen, insbesondere in Richtung hochempfindlicher Nachweisreagenzien und fortschrittlicher Bildgebungsverfahren, machen die WB zu einem potenziellen Werkzeug für die quantitative Analyse. Die quantitativen Anwendungen beinhalten eine Definition der Proteinmenge in relativer oder absoluter Hinsicht. Dabei sind einige Faktoren wie Empfindlichkeit, Signalstabilität, linearer Dynamikbereich, Normalisierung und das Signal-Rausch-Verhältnis zu berücksichtigen. Das Minimum an Protein, das in einem bestimmten Assay gesehen werden kann, ergibt die Nachweisgrenze (LOD), und die Grenze der Signalintensität, die zuverlässig für eine präzise Quantifizierung verwendet werden kann, ist die Bestimmungsgrenze (LOQ). Faktoren, die diese Begriffe beeinflussen, sind die Antikörperqualität und -konzentration sowie die Belichtungszeiten, wenn man die minimale Menge an detektiertem Protein betrachtet. Ein stabiles Signalsystem erweitert das Zeitfenster für das Erreichen einer hohen Empfindlichkeit, Mehrfachbelichtungen und die Möglichkeit, schwache Banden zu erkennen. Der Bereich, der eine gleichmäßige und präzise Quantifizierung ermöglicht, bei der die Signalintensität noch proportional zur Proteinmenge ist, wird als linearer dynamischer Bereich bezeichnet. Es ist wichtig, eine Signalsättigung durch zu große Proteinmengen oder hohe Konzentrationen von Antikörpern zu vermeiden. Eine niedrige LOD und die Quantifizierung sowohl von schwachen als auch von starken Signalen ergibt einen breiten linearen dynamischen Bereich. Das interessierende Protein sollte auf eine interne Referenz normalisiert werden, die Schwankungen in der Menge des in jede Vertiefung geladenen Proteins oder unterschiedliche Konzentrationen zulässt. Dies kann mit Housekeeping- oder Spiked-Protein erreicht werden. Das Verhältnis zwischen Signal und Rauschen ist wichtig, um das Protein richtig zu quantifizieren. Dies ist besonders wichtig, wenn schwache Banden detektiert werden, bei denen ein höherer Hintergrund zu erwarten ist.

Spezifische Beispiele

Obwohl das theoretische Gewicht vieler Proteine aufgrund von posttranslationalen Modifikationen vom realen Gewicht abweicht, werden fast alle kommerziellen Antikörper mittels WB validiert.

Im Rahmen des Human Protein Atlas Projekts wird WB zur Qualitätskontrolle der im Projekt generierten polyklonalen Antikörper eingesetzt. Nach der Aufreinigung werden die Antikörper zum Nachweis von Banden in einem Setup aus Lysat und verschiedenen Geweben verwendet. Die Verwendung von siRNA-WB wird derzeit implementiert, um die Antikörper weiter zu analysieren.

Das gesamte WB-Protokoll, einschließlich der Verdünnung der Primär- und Sekundärantikörper und des abschließenden Detektionsschritts, wird routinemäßig durchgeführt und es wird keine spezifische experimentelle Optimierung für einzelne Antikörper vorgenommen. Zunächst werden Gesamtproteinlysate von ausgewählten Zelllinien und Geweben (15?g von RT-4, U-251MG, Leber und Tonsille sowie 25?g HSA- und IgG-abgereichertes Plasma) und ein Marker (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; Thermo Scientific) auf vorgefertigte 4-20%ige Criterion SDS-PAGE Gradientengele (Bio-Rad Laboratories) geladen und unter reduzierenden Bedingungen laufen gelassen, gefolgt von einem Transfer auf PVDF-Membranen (Bio-Rad Laboratories) unter Verwendung von Trans-Blot turbo (Bio-Rad Laboratories) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Die Criterion SDS-PAGE Gradientengele ermöglichen zusammen mit dem Marker die Analyse von Proteinen im Größenbereich von 10 bis 250 kDa. Die Membranen werden anschließend in Methanol aktiviert, bevor sie für 1 h bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln blockiert werden (5% Trockenmilch, 0,5% Tween 20, 1× TBS; 1 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl). Die Membranen werden dann mit dem primären HPA-Antikörper, verdünnt auf ~0,6?g/ml, für 1 h inkubiert, gefolgt von Waschen (1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween) und Inkubation für 45 Minuten mit dem sekundären Peroxidase-konjugierten Antikörper (Schwein-Anti-Kaninchen 1:4000, Dako). Bei kommerziellen Antikörpern wird eine Verdünnung von 1:500 verwendet und der sekundäre Antikörper ist entweder Schwein-Anti-Kaninchen (1:3000, Dako) oder Ziege-Anti-Maus (1:3000, Dako). Eine CCD-Kamera (Bio-Rad Laboratories) wird für die Detektion des Signals vom Substrat (Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate; Millipore) verwendet.

Ein typischer Western Blot von HPA ist in Abbildung 5 zu sehen.

Abbildung 5. Typisches Western Blot-Ergebnis unter Verwendung von HRP und einer CCD-Kamera.

Referenzen und Links

Der Artikel benennt die Methode und beschreibt sie näher:
Burnette WN., „Western blotting“: Elektrophoretische Übertragung von Proteinen aus Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen auf unmodifizierte Nitrocellulose und radiographische Detektion mit Antikörper und radiojodiertem Protein A. Anal Biochem. (1981)
PubMed: 6266278

Der Artikel beschreibt Western Blotting Technik, Theorie und Fehlersuche:
Mahmood T et al., Western Blot&Kolon; Technik&Komma; Theorie&Komma; and trouble shooting. N Am J Med Sci. (2012)
PubMed: 23050259 DOI: 10.4103/1947-2714.100998

Der erste Artikel, der den elektrophoretischen Transfer von Proteinen auf eine Membran beschreibt:
Towbin H et al, Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. (1992)
PubMed: 1422008

Western Blotting Principles and Methods – ein kostenloses Handbuch von GE Healthcare:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-se/service-and-support/handbooks

Western Blotting im Human Atlas Protein Projekt:
Western Blotting

Wikipedia – relevante Links:
Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Western Blot Enzyklopädie – Viele nützliche Informationen zum Western Blot sowie Troubleshooting, Protokolle und Antikörperauswahl:
http://www.western-blot.us

Antibodypedia – Eine frei zugängliche Datenbank mit öffentlich zugänglichen Antikörpern und deren Nützlichkeit in verschiedenen Anwendungen:
http://www.antibodypedia.com

VIDEO: Schritt für Schritt Western Blotting, ein Tutorial von Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu