En este post discutimos el fenómeno de la difracción de segundo orden a través de un monocromador y los problemas que puede causar en la espectroscopia de fluorescencia.
Esta es la segunda de una serie de entradas del blog (leer la primera entrada del blog) en la que discutimos los errores más comunes que se cometen, y los artefactos experimentales que aparecen al medir los espectros de fluorescencia. Esta lista se inspiró originalmente en la «Galería de artefactos y errores de fluorescencia» del excelente libro «Introduction to Fluorescence» de David M. Jameson.1 Estas entradas del blog se basarán en esa lista con la experiencia de nuestros propios ingenieros de operaciones y científicos de aplicaciones de los errores comunes que observan al responder a las preguntas de los clientes, visitar laboratorios y… ocasionalmente hacer nosotros mismos.
¿Qué es la difracción de segundo orden?
En la espectroscopia de fluorescencia se utilizan monocromadores para seleccionar las longitudes de onda de excitación y emisión. Un espectrómetro de fluorescencia típico consta de dos monocromadores: un monocromador de excitación para seleccionar la longitud de onda de excitación deseada y un monocromador de emisión para seleccionar la longitud de onda que llega al detector. Para más información sobre cómo funciona un espectrómetro de fluorescencia, lea nuestro artículo «Introducción a las mediciones de fluorescencia & Instrumentación».
Los monocromadores utilizan rejillas de difracción para aislar la longitud de onda deseada de la luz de banda ancha incidente. La luz de banda ancha se proyecta sobre la rejilla de difracción y las diferentes longitudes de onda que componen la luz se difractan en diferentes ángulos con el fin de satisfacer la ecuación de la rejilla,
donde m es el orden de la difracción, λ es la longitud de onda de la luz difractada, d es la separación entre ranuras de la rejilla, es el ángulo entre la luz incidente y la normal de la rejilla, θί es el ángulo entre la luz difractada y la normal de la rejilla. Se puede ver que para constante cada longitud de onda de la luz será difractada en un ángulo diferente que permite al monocromador aislar la longitud de onda deseada. También se puede ver que para constante y constante λ la ecuación se satisface con diferentes ángulos dependiendo del orden de difracción m que puede tomar valores enteros positivos y negativos (…-2, -1, 0, 1, 2…). Un valor de ±1 se denomina difracción de primer orden y se produce cerca de la normal de la rejilla y es el de mayor intensidad. Del mismo modo, un valor de ±2 se conoce como difracción de segundo orden y se produce en un ángulo menor y es más débil en intensidad. La difracción en órdenes superiores sigue un patrón similar de aumento del ángulo de alejamiento de la normal y de reducción de la intensidad.
En un monocromador sólo se utiliza la difracción de primer orden (ya sea +1 o -1) para seleccionar la longitud de onda deseada y los órdenes superiores no son deseados. Sin embargo, debido a la amplia gama de longitudes de onda que se difractan, los rangos de ángulos ocupados por la difracción de primer y segundo orden no son únicos. Esto se ilustra en la figura 1, en la que el cono azul representa el rango de ángulos en los que se difracta la luz de primer orden y el cono rojo es el rango de ángulos en los que se ha difractado la luz de segundo orden y hay una región de solapamiento compartida entre estos rangos. Este rango compartido también puede verse en la ecuación de la rejilla. Consideremos la luz a 600 nm que es difractada de primer orden (m = 1, λ = 600 nm) y la luz a 300 nm que es difractada de segundo orden (m = 2, λ = 300); está claro que el lado izquierdo de la ecuación de la rejilla es el mismo para ambos casos y el ángulo de la luz difractada debe, por tanto, ser equivalente. La consecuencia de esto es que cuando el monocromador se ajusta para transmitir 600 nm, también se transmitirá una pequeña fracción de luz de 300 nm, lo que puede ser problemático para la espectroscopia de fluorescencia.
La aparición de la difracción de segundo orden en los espectros de fluorescencia
La difracción de segundo orden es un problema particular para las muestras de dispersión como polvos, cristales y suspensiones coloidales. Para mostrar el efecto que la difracción de segundo orden tiene en los espectros de fluorescencia, se preparó una muestra fluorescente de dispersión mezclando una solución del colorante fluorescente 2-aminopiridina con Ludox, que es una suspensión coloidal de nanopartículas de sílice y que sirve como dispersor. La solución se excitó a 300 nm y se midió el espectro de emisión en un rango de 250 nm a 950 nm, como se muestra en la figura 2, utilizando el espectrómetro de fotoluminiscencia FLS1000 con el filtro de clasificación de orden (véase la sección siguiente) del monocromador de emisión desactivado.El primer pico a 300 nm corresponde a la dispersión de Rayleigh de la luz de excitación de 300 nm que ha sido difractada de primer orden en el monocromador de emisión. A esto le sigue la fluorescencia de primer orden de la 1-aminopiridina que alcanza un pico a 380 nm. Estos picos se repiten como artefactos de segundo orden con un pico de dispersión Rayleigh a 600 nm y un pico de fluorescencia a 760 nm. También puede verse un débil pico de dispersión de Rayleigh de tercer orden a 900 nm. Confundir los artefactos de segundo orden con la verdadera emisión de fluorescencia es un error común entre los usuarios inexpertos de la fluorescencia y ha sido incluso la causa de informes erróneos en la literatura. Un ejemplo de esto es la publicación de un artículo que informaba de nuevas bandas débiles de emisión de longitud de onda larga de triptófano y tirosina a 675 nm y 600 nm que se sumaban a la conocida emisión UV de estos residuos proteicos.3 Seis meses después, Hutnik et al. publicaron una refutación que mostraba que la supuesta fluorescencia de onda larga era simplemente la difracción de segundo orden de la verdadera emisión UV de triptófano y tirosina a 340 nm y 300 nm.4
Eliminación de la difracción de segundo orden utilizando filtros de orden
El hecho de confundir y publicar un artefacto de segundo orden es un ejemplo extremo, pero un problema más común es que la dispersión de segundo orden a menudo se solapa con la emisión de fluorescencia que se está midiendo y distorsiona el espectro. La figura 3a muestra el espectro de emisión de la misma muestra de Ludox / 2-aminopiridida que se utilizó en la figura 2, pero la longitud de onda de excitación se ha desplazado a 240 nm y el rango de emisión se ha reducido. La dispersión de segundo orden está ahora a 480 nm y se solapa con la cola de la fluorescencia de la 2-aminopiridina, lo que impide una medición precisa del espectro.La solución a este problema es utilizar filtros de clasificación de orden dentro del monocromador. Los filtros de selección de orden son filtros de paso largo que sólo transmiten longitudes de onda por encima de la longitud de onda de corte del filtro. El principio de los filtros de selección de orden dentro del monocromador se ilustra en la figura 4, donde los filtros de selección de orden están montados en una rueda de filtros situada delante de la rendija de salida. Cuando el monocromador está configurado para transmitir 300 nm, la rejilla de difracción se gira para que la luz difractada de 300 nm se dirija a la rendija de salida del monocromador y la rueda de filtros se gira para que no haya ningún filtro de paso largo en la trayectoria de la luz y la luz de 300 nm salga del monocromador como se desea (imagen izquierda). Cuando el monocromador está configurado para transmitir luz de 600 nm, la rejilla de difracción se gira para que la luz de 600 nm difractada de primer orden se dirija a la rendija de salida, acompañada de una pequeña cantidad de luz de 300 nm de segundo orden. La rueda de filtros se gira de modo que haya un filtro de paso largo de 400 nm delante de la rendija de salida que transmite la luz de 600 nm deseada mientras bloquea la luz de 300 nm no deseada (imagen derecha).
El beneficio de los filtros de ordenación se muestra en la Figura 3b, donde se volvió a medir el espectro con la rueda de filtros de ordenación automática del monocromador de emisión del FLS1000 ahora habilitada. El filtro de ordenación elimina el pico de dispersión de segundo orden a 480 nm y se obtiene el verdadero espectro de la 2-aminopiridina. Los espectrómetros FLS1000 y FS5 de Edinburgh Instruments están equipados con ruedas de filtro de clasificación de orden en los monocromadores de excitación y emisión como estándar. Estas ruedas de filtros están habilitadas por defecto y son totalmente automáticas, con el software Fluoracle® del FLS1000 y FS5 seleccionando los filtros apropiados a utilizar en base a la elección de la longitud de onda de excitación y las longitudes de onda de emisión. Estas ruedas de filtros automáticas permiten al usuario medir espectros de fluorescencia amplios sin preocuparse nunca de que los artefactos de segundo orden distorsionen sus mediciones.
Esperamos que esta entrada del blog le haya ayudado a comprender la presencia de artefactos de segundo orden en los espectros de fluorescencia y cómo pueden evitarse mediante el uso de filtros de selección de orden.
- Introducción a la fluorescencia, D. M. Jameson, CRC Press (2014)
- Principios de espectroscopia de fluorescencia 3ª, J. R. Lakowicz, Springer (2006)
- Macías, M. C. Pinto, C. Gutiérrez-Mérino, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan Solutions, Biochem Int. 15, 961-969 (1987)
- M. Hutnik, A. G. Szabo, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan: a Classic Example of Second Order Diffraction, Biochem Int. 16, 587-591 (1988)
Espectrómetros para evitar la difracción de segundo orden
Los espectrómetros FS5 y FLS1000 establecen el estándar en la espectroscopia de fotoluminiscencia de estado estable y resuelta en el tiempo, tanto para la investigación fundamental como para las aplicaciones rutinarias de laboratorio. Para obtener más información sobre nuestros FLS1000 y FS5, póngase en contacto con un miembro de nuestro equipo en [email protected].
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