La espectroscopia ultravioleta-visible, o UV-Vis, es una de las técnicas analíticas más populares en el laboratorio.
En la espectroscopia UV-Vis, se hace pasar la luz a través de una muestra a una longitud de onda específica en el espectro UV o visible. Si la muestra absorbe parte de la luz, no toda la luz pasará, o se transmitirá. La transmisión es la relación entre la intensidad de la luz transmitida y la luz incidente, y está correlacionada con la absorbancia. La absorbancia puede utilizarse de forma cuantitativa, para obtener la concentración de una muestra. También puede utilizarse de forma cualitativa, para identificar un compuesto haciendo coincidir la absorbancia medida en un rango de longitudes de onda, llamado espectro de absorbancia, con los datos publicados. Este vídeo presentará la espectroscopia UV-Vis y demostrará su uso en el laboratorio para determinar la concentración de la muestra y la cinética de la reacción.
Cuando un fotón incide en una molécula y es absorbido, la molécula pasa de su estado básico a un estado de mayor energía. La diferencia de energía entre ambos es la brecha de banda. La energía del fotón debe coincidir exactamente con la brecha de banda para que el fotón sea absorbido. La estructura química determina la brecha de banda; por lo tanto, cada molécula tiene espectros de absorbencia únicos.
La absorbencia sigue la Ley de Beer, que establece que la absorbencia es igual al coeficiente de atenuación molar por la longitud del camino y la concentración. El coeficiente de atenuación molar está relacionado con la capacidad del compuesto individual para absorber la luz de una longitud de onda específica. La longitud del trayecto se refiere a la distancia recorrida por la luz a través de la muestra, que suele ser de 1 cm para las cubetas estándar. La ley de Beer puede utilizarse para calcular la concentración de la muestra, si se conoce la absorbencia, o puede utilizarse una curva de calibración.
La UV-Vis suele denominarse una técnica general, ya que la mayoría de las moléculas absorben la luz en el rango de longitudes de onda UV-visible. El rango UV se extiende desde 100-400 nm, y el espectro visible va desde 400-700 nm. Sin embargo, la mayoría de los espectrofotómetros no funcionan en el rango UV profundo de 100-200 nm, ya que las fuentes de luz en este rango son caras. La mayoría de los espectrofotómetros UV-Vis utilizan una lámpara de deuterio para el rango UV, que produce luz de 170-375 nm, y una lámpara de filamento de tungsteno para el rango visible, que produce luz de 350-2.500 nm.
Dado que la fuente de luz suele ser una lámpara con amplios rangos de longitud de onda, la longitud de onda de absorbancia específica se selecciona utilizando filtros o un monocromador. Un monocromador es un dispositivo que separa espacialmente las longitudes de onda de la luz y, a continuación, coloca una rendija de salida donde se encuentra la longitud de onda de la luz deseada. El monocromador puede ser escaneado en un rango de longitudes de onda para proporcionar un espectro de absorbancia completo. Esto hace que la técnica sea útil para cuantificar e identificar una amplia gama de moléculas.
Ahora que se han esbozado los fundamentos de la espectroscopia UV-Vis, echemos un vistazo a un sencillo experimento de UV-Vis en el laboratorio.
Antes de comenzar la medición, encienda el espectrofotómetro y deje que las lámparas se calienten durante un período de tiempo adecuado para estabilizarlas.
Prepare un blanco llenando una cubeta limpia con el disolvente de la muestra y, a continuación, limpie el exterior con un papel sin pelusas para eliminar cualquier huella dactilar.
Asegúrese de que la cubeta está correctamente alineada con cualquier lado ranurado fuera de la trayectoria del haz, e insértela en el espectrofotómetro. Asegure la tapa para evitar que la luz ambiental entre en el sistema.
Mida la absorbancia del blanco en una longitud de onda, o en un rango de longitudes de onda. Registre o guarde la absorbancia, ya que debe restarse de la absorbancia de la muestra.
A continuación, deseche el blanco y enjuague la cubeta dos veces con muestra. A continuación, llene la cubeta unos ¾ de su capacidad con muestra. Vuelva a limpiar el exterior de la cubeta para asegurarse de que está limpia y sin huellas dactilares.
Coloque la cubeta en el espectrofotómetro en la orientación correcta y fije la tapa.
Recoja una medición o espectro de absorbancia en la misma longitud de onda o rango de longitudes de onda que el blanco. Reste el espectro o la medición del blanco, si el instrumento no lo hace automáticamente.
A partir del espectro de absorbancia recogido, determine el máximo de absorbancia, o λmax.
Para cuantificar la cantidad de analito en la muestra, cree una curva de calibración utilizando un rango de concentraciones de analito conocidas. Para obtener más información sobre cómo construir y utilizar una curva de calibración, vea el vídeo de esta colección «Curvas de calibración».
La medición de la absorbancia también puede utilizarse para calcular la cinética de la reacción midiendo el aumento o la disminución de la concentración de un compuesto a lo largo de la reacción. Comience tomando una lectura inicial de la muestra, colorante azul en este caso, en el máximo de absorbancia antes de la reacción.
A continuación, añada rápidamente el reactivo, lejía en este caso, para iniciar la reacción química. Agítelo bien, para que se mezcle con la muestra.
Mida la absorbancia en el máximo de absorbancia a lo largo del tiempo.
Se muestra el espectro de absorbancia inicial de la muestra de colorante azul. Los colores del fondo muestran los colores de la luz en el espectro visible. El colorante azul tiene un máximo de absorbancia a unos 630 nm.
Se midió la cinética de la reacción entre el colorante azul y la lejía a lo largo del tiempo. La absorbancia del colorante azul disminuye con el tiempo, ya que reacciona con la lejía. La absorbancia llega casi a cero después de 300 s, lo que indica que la reacción se ha completado. Para obtener más información sobre la cinética y las reacciones, vea el vídeo de JoVE Science Education «Reaction Rate Laws».
La espectroscopia UV-Vis se utiliza mucho en muchas áreas de investigación diferentes para identificar o cuantificar una muestra.
Por ejemplo, la espectroscopia UV-Vis se utiliza mucho en los campos biológicos para cuantificar la cantidad de proteínas en una muestra. Para cuantificar las proteínas se suele utilizar un ensayo de Bradford, con la ayuda de un colorante. En primer lugar, se prepara una curva de calibración de concentraciones conocidas de proteínas, normalmente con albúmina de suero bovino o BSA. A continuación, se añade el colorante azul de Coomassie a cada uno de los estándares y a la muestra. La absorbancia del complejo proteína-tinte se mide entonces a 595 nm.
Alternativamente, las proteínas pueden medirse directamente por su absorbancia a 280 nm. En este ejemplo, la concentración de proteínas se cuantifica utilizando un espectrofotómetro de volumen ultrabajo. Para muchas proteínas, una absorbancia de 1 se correlaciona con una concentración de 1 mg/mL.
La espectroscopia UV-Vis también se utiliza para cuantificar la cantidad de células bacterianas en un cultivo celular. Para esta medición, la absorbancia, o densidad óptica, se mide a 600 nm. Normalmente, una medición de OD600 de 1 indica la presencia de 8 x 108 células bacterianas por mL. La medición de la densidad celular a lo largo del crecimiento del cultivo permite determinar la curva de crecimiento bacteriano y puede ayudar a identificar cuándo un cultivo se encuentra en su fase de crecimiento exponencial.
El óxido de nitrógeno y el dióxido de nitrógeno, o NOx, es un subproducto de los gases de escape de los automóviles y puede ser perjudicial para el medio ambiente porque forma el dañino ozono troposférico. El NOx puede medirse haciéndolo reaccionar con una solución de ácido sulfanílico y naftil-etilendiamina. La solución resultante es una molécula de colorante azoico de color rosa, cuya intensidad está directamente correlacionada con la concentración de NOx. Esta concentración puede entonces determinarse utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.
Acabas de ver la introducción de JoVE a la espectroscopia UV-visible. Ahora debería entender los fundamentos del funcionamiento de la UV-Vis, cómo medir una muestra utilizando un UV-Vis y cómo correlacionar la absorbancia con la concentración de la muestra.
¡Gracias por ver!