El tamaño y la densidad de los estomas del trigo cambia con la ploidía
Para investigar si las características estomáticas varían con el nivel de ploidía en el trigo, examinamos el tamaño y el patrón de los estomas en dos especies diploides (2n) (Triticum baeoticum y T. urartu), dos especies tetraploides (4n) (T. araraticum, T. dicoccoides) y tres cultivares del hexaploide (6n) T. aestivum (cv. Cougar, Crusoe y Shango). Las especies de trigo presentan los estomas característicos de las gramíneas, con los complejos estomáticos (cada uno de ellos compuesto por un par de células de guarda flanqueadas por células subsidiarias) dispuestos en filas de células epidérmicas a lo largo de la superficie de la hoja. En la Fig. 1a-c se muestran imágenes de ejemplo que muestran la distribución general de los estomas en los diferentes fondos de ploidía, y en la Fig. 1d-f se muestran imágenes de mayor resolución de complejos estomáticos individuales. Estas imágenes sugieren que el tamaño y la densidad de los estomas de la hoja están influenciados por la ploidía en el trigo. La medición de estos parámetros seguida de un análisis estadístico (ANOVA con Tukey posthoc) mostró que los complejos estomáticos de los cultivares hexaploides eran más anchos que los de las especies tetraploides (P < 0,001) y diploides (P < 0,001), que a su vez eran indistinguibles (P = 0,115; Fig. 1g). Por el contrario, la longitud de los complejos estomáticos fue indistinguible entre las líneas tetraploides y hexaploides (ANOVA con Tukey posthoc, P = 0.479), mientras que los estomas fueron significativamente más cortos en los trigos diploides que en las líneas tetraploides (P < 0,001) y hexaploides (P < 0,001; Fig. 1i). Así, dado que el área del complejo estomático depende tanto de la longitud como de la anchura de los estomas, las diferencias escalonadas de estos parámetros entre los tres fondos de ploidía conducen a que el tamaño de los estomas sea distinto en cada nivel de ploidía (ANOVA con Tukey posthoc, diploide/tetraploide P < 0.001; tetraploide/hexaploide P < 0,001). Los complejos estomáticos fueron menores en las especies diploides, mayores en los cultivares hexaploides e intermedios en las especies tetraploides (Fig. 1h). El aumento gradual de la longitud del complejo estomático mostrado en la Fig. 1i se reflejó en la densidad estomática (Fig. 1j), con las especies diploides teniendo densidades claramente más altas que las observadas en las especies tetraploides (ANOVA con Tukey posthoc, P < 0.001) y las especies hexaploides (P < 0,001) (que no pudieron distinguirse entre sí en función de la densidad estomática; P = 0,616). Nuestros datos sugieren que ha habido una selección indirecta de hojas con mayor tamaño pero relativamente menos estomas durante la compleja domesticación del trigo hexaploide moderno. Esto parece haber ocurrido de forma escalonada, de manera que los tetraploides se distinguen de los diploides por tener estomas más largos y menos densos de anchura similar, y los cultivares de trigo panificable modernos hexaploides tienen complejos estomáticos más amplios que sus parientes silvestres tetraploides, lo que probablemente ocurrió posteriormente o simultáneamente a la fusión de los progenitores diploides y tetraploides.
El patrón estomático cambia con el nivel de ploidía en el trigo. Imágenes de muestra de la distribución estomática global a lo largo de la epidermis adaxial (a-c) y de complejos estomáticos individuales (d-f) en Triticum baeoticum (2n; a, d), T. araraticum (4n; b, e) y T. aestivum cv Cougar (6n; c, f). Barra de escala a-c = 80 µm; d-f = 20 µm. Anchura estomática (g) (ANOVA, F(2,81) = 169,5, P < 0,0001), área (h) (ANOVA, F(2,81) = 218,7, P < 0,0001), longitud (i) (ANOVA, F(2,73) = 80.29 p < 0,0001), densidad (j) (ANOVA, F(2,81) = 61,21 P < 0,0001), y conductancia, gs (k) (ANOVA, F(2,25) = 7,494, P = 0,0028) se muestran para todas las líneas de trigo analizadas. Los resultados de una prueba posthoc de Tukey que compara los niveles secuenciales de ploidía se indican dentro de cada análisis, con un asterisco cuando son significativos al nivel p < 0,05 o NS cuando no son significativos. Para g-k, los datos se muestran como diagramas de caja (percentil 25-75, línea horizontal = mediana) con bigotes que indican los valores máximos y mínimos, n = 6. l Para cada línea de trigo analizada, la porosidad media del mesófilo se traza contra la conductancia estomática media, gs, con el nivel de ploidía indicado para cada punto. Se presentan los resultados del análisis de correlación (valor r2 de Pearson). Los resultados de los datos individuales emparejados se muestran en la Fig. Suplementaria. 2
El espacio aéreo del mesófilo y el patrón estomático están coordinados
Para investigar las posibles relaciones entre la variación observada en las características estomáticas y el patrón del mesófilo, utilizamos el análisis de imágenes de microCT de alta resolución para cuantificar la porosidad y la superficie del mesófilo en las mismas líneas de trigo utilizadas para la caracterización estomática anterior. En la Fig. 2 se muestran imágenes de ejemplo de T. urartu, T. araraticum y T. aestivum cv Cougar como reconstrucciones 3D de segmentos de hoja (Fig. 2a-c), con secciones transversales de ejemplo (Fig. 2d-f), secciones longitudinales (Fig. 2g-i) y secciones paradérmicas (Fig. 2j-l) en las que el espacio aéreo se representa en amarillo y el material celular en verde. Las imágenes equivalentes para las otras líneas de trigo analizadas se muestran en la Fig. 1 suplementaria. Estas vistas muestran que todas las hojas de trigo muestran una anatomía clásica de hoja de hierba, consistente en venas paralelas a lo largo del eje longitudinal de la hoja que forman los límites del tejido mesófilo. La separación celular dentro del tejido mesófilo forma un patrón altamente regular de espacio aéreo que se demuestra claramente en las vistas longitudinales y paradérmicas (Fig. 2g-l), mientras que las secciones mostradas en la Fig. 2j-l proporcionan una indicación de las diferencias en el tamaño, la distribución y la cantidad general de espacio aéreo entre las especies de trigo. La MicroCT proporciona un medio para cuantificar estas diferencias, no simplemente en secciones 2D sino a través de la profundidad 3D del tejido. El análisis de la porosidad del tejido (es decir, el volumen del espacio aéreo como proporción del volumen total del tejido) desde la superficie adaxial (superior) a la abaxial (inferior) de las hojas reveló similitudes y diferencias en la cantidad y distribución del espacio aéreo. Todas las especies mostraron un patrón de porosidad creciente a medida que se alejaban de la epidermis, con una meseta de porosidad relativamente alta en la parte media de la hoja (Fig. 2m-o). La tasa de aumento de la porosidad con la distancia hacia el interior de la hoja fue mayor para las especies diploides (Fig. 2m), mientras que las especies hexaploides mostraron un gradiente de porosidad menos profundo (Fig. 2o) y, en general, un valor de porosidad máximo más bajo que el observado en las especies diploides. Las especies tetraploides mostraron patrones intermedios de porosidad en toda la profundidad de la hoja (Fig. 2n). En general, nuestro análisis de los parámetros estructurales a través de las hojas de trigo de diferente ploidía sugiere que mientras el patrón básico de distribución del espacio aéreo y de los tejidos dentro de la hoja se ha conservado durante la evolución del trigo hexaploide a partir de los parientes silvestres diploides y tetraploides, ha habido selección, ya sea directa o indirecta, para una estructura foliar con menor porosidad (es decir,
Las imágenes de MicroCT revelan la variación en el espacio aéreo de la hoja de trigo con la ploidía. Imágenes de muestras de hojas de Triticum urartu (2n), T. araraticum (4n) y T. aestivum cv Cougar (6n) en representaciones 3D de bloques de tejido (a-c), secciones transversales (d-f), secciones longitudinales (g-i) y secciones paradermales (j-l), con el tejido sólido en verde y el espacio aéreo en amarillo. La porosidad del mesófilo (%) (m-o) se representa a lo largo de la profundidad de la hoja desde la superficie adaxial a la abaxial en las líneas diploide (m), tetraploide (n) y hexaploide (o), según se indica. T. baoeticum-azul oscuro; T. urartu-azul claro; T. dicoccoides-anaranjado oscuro; T. araraticum-anaranjado claro; T. aestivum (Crusoe)-verde oscuro; T. aestivum (Cougar)-verde medio; T. aestivum (Shango)-verde claro. Para mayor claridad, sólo se presentan los valores medios de 6 muestras replicadas en los paneles m-o. Las líneas en a-c indican el plano de la sección en g-i, respectivamente, también indicado por las líneas verticales en j-l. Las líneas horizontales en j-l indican el plano de sección para d-f, respectivamente. Resolución de la imagen = 2,75 µm. Barras de escala a-l = 200 µm
El intercambio de gases refleja el espacio aéreo y el patrón estomático
Utilizando la diversidad representada en estos parientes del trigo, procedimos a investigar los efectos de las tendencias observadas en el tamaño/densidad estomática y el espacio aéreo del mesófilo en el intercambio de gases, mediante mediciones de la conductancia estomática al vapor de agua (gs) y estimaciones de la conductancia estomática máxima (gsmax). Estos datos revelaron una sorprendente correlación positiva entre la porosidad del mesófilo y gs (r2 = 0.915, P = 0.0007; Fig. 1l) con especies diploides mostrando alta gs y alta porosidad y hojas hexaploides teniendo una baja gs y baja porosidad (Fig. 1k). Esta fuerte correlación de la porosidad del mesófilo y la gs se mantuvo cuando se consideraron los datos emparejados de plantas individuales para las distintas líneas analizadas (correlación de Pearson, r2 = 0,451, P = 0,0001; Fig. 2 suplementaria). La disminución de la porosidad asociada a un mayor nivel de ploidía también se relacionó con una disminución de la superficie de mesófilo expuesta por volumen de tejido, lo que dio lugar a una fuerte correlación positiva de gs y este parámetro (correlación de Pearson, r2 = 0,718, P = 0,016; Fig. suplementaria 3a) que también se observó cuando la superficie de mesófilo expuesta se expresó en base al área foliar (correlación de Pearson, r2 = 0,633, P = 0,0323; Fig. suplementaria 3b). La relación de gsmax (calculada usando mediciones como se muestra en la Fig. Suplementaria 3e) y la porosidad fue menos fuerte (correlación de Pearson, r2 = 0.487, P = 0.081; Fig. Suplementaria 3c) que la observada con gs (Fig. 1l). El análisis de gsmax y el área estomática reveló una correlación inversa (correlación de Pearson, r2 = 0,613, P = 0,037) (Supplementary Fig. 3d) consistente con trabajos anteriores que indican una compleja compensación entre el tamaño y la densidad estomática en gs, con hojas que muestran altas densidades de estomas más pequeños que transmiten mayor gs por área estomática que hojas con bajas densidades de estomas más grandes20,21. En general, nuestro análisis de gs, la porosidad del mesófilo y la superficie expuesta es consistente con la hipótesis de que una mayor superficie expuesta del mesófilo y la asignación de volumen de tejido al espacio aéreo facilita una mayor difusión gaseosa hacia y desde el mesófilo.
La relación entre los estomas y el espacio aéreo del mesófilo
Los análisis presentados anteriormente son consistentes con, pero no prueban, una relación causal entre la diferenciación estomática y la formación del espacio aéreo del mesófilo. Para probar esta hipótesis utilizamos una serie de líneas transgénicas de trigo con propiedades estomáticas alteradas. Existen evidencias significativas de que el patrón estomático se controla a través de una serie de señales peptídicas móviles, los Factores de Patrones Epidérmicos (EPFs)22,23,24, que proporcionan herramientas eficaces para alterar la densidad estomática y, por tanto, investigar el resultado en la diferenciación del mesófilo7. Se ha demostrado que la sobreexpresión de EPF1 o de su pariente cercano EPF2 en Arabidopsis conduce a una disminución de la densidad estomática25 y recientemente se ha demostrado que la sobreexpresión de un gen afín en el trigo (TaEPF1) conduce a un fenotipo similar26.
Las imágenes confocales de las líneas TaEPF1-OE revelaron que algunas células de los archivos epidérmicos formadores de estomas parecen haber sufrido los eventos iniciales de la formación de los estomas pero no lograron someterse al proceso de división final para generar el complejo estomático y el poro (Fig. 3a). Las células del mesófilo que subyacen directamente a estos progenitores estomáticos anormales no mostraron signos de separación celular, mientras que los estomas maduros en mostraron claras cavidades subestomáticas (Fig. 3b, c). El recuento de la presencia/ausencia de cavidades subestomáticas confirmó la ausencia total de cavidades en el espacio aéreo por debajo de las células del linaje estomático abortado en las líneas de trigo TaEPF1-OE, mientras que todos los estomas diferenciados estaban subtendidos por cavidades (Fig. 3h). Las imágenes de microCT de las hojas de TaEPF1-OE también revelaron una falta de cavidades subestomáticas en comparación con WT (Fig. 3d, e) y un mesófilo más denso (Fig. 3f, g). La cuantificación de la estructura de la hoja reveló que las hojas TaEPF1-OE tenían efectivamente una menor porosidad que las WT (Fig. 3i). Las mediciones del intercambio de gases revelaron una disminución significativa de gs en las líneas TaEPF1-OE en comparación con las hojas no transgénicas de control (Fig. 3j).
La sobreexpresión de EPF detiene el desarrollo de la cavidad subestomática y disminuye la porosidad del mesófilo en el trigo. a Vista general confocal de una hoja de trigo TaEPF1 OE que muestra la capa epidérmica (púrpura), las células del mesófilo subyacente (verde), un estomato (St) formado por células guardianas y células subsidiarias asociadas y, en el mismo archivo, un precursor estomático detenido (Ap). Barra de escala = 60 µm. b, c Imágenes de mayor resolución de (b) el estomato y (c) la célula precursora estomática detenida mostrada en a. Barras de escala = 40 µm. d-g Imágenes de microCT de una hoja de tipo salvaje (WT) (d, f) y de una hoja de TaEPF1 OE (e, g) en un plano paradérmico dentro del mesófilo que subtiende directamente a la epidermis (d, e) o más profundamente en la hoja (f, g), con tejido sólido en verde y espacio aéreo en amarillo. Los espacios aéreos más grandes en d, e indican cavidades subestomáticas. Obsérvese que hay menos cavidades subestomáticas en la hoja de TaEPF1 OE. Barras de escala = 100 µm. h-j En el trigo WT y dos líneas independientes de trigo transgénico que sobreexpresan TaEPF1 (como se indica), (h) la densidad de estomas (n = 87), cavidades subestomáticas (n = 87) y células precursoras de estomas detenidas (n = 52 de 5 hojas independientes); (i) la porosidad del mesófilo medida a partir del análisis de microCT (ANOVA, F(2,12) = 4.977, p = 0,027); y (j) conductancia estomática, gs, se muestran (ANOVA, F(2,12) = 46,86, p < 0,0001). Para i y j se realizó un análisis posthoc Tukey (n = 5). Las líneas que comparten la misma letra son indistinguibles entre sí en el límite de confianza p < 0,05. Los datos (h-j) se muestran como gráficos de caja (percentil 25-75, línea horizontal = mediana) con bigotes que indican los valores máximos y mínimos
Para investigar más a fondo la posible relación de la separación celular subepidérmica con los eventos de diferenciación estomática, explotamos el hecho de que el eje longitudinal de una hoja de hierba proporciona un gradiente de desarrollo de la diferenciación de los tejidos, con células en la base proximal que se someten a la división para generar células que entran en una serie de vías de desarrollo, incluyendo la formación de estomas, en las regiones de la punta más distal23. El análisis de la línea de control (el progenitor no transformado de las plantas transgénicas TaEPF1-OE) no reveló ningún gradiente en la densidad estomática en las regiones observadas en la punta, el centro o la base de la hoja madura 5 (Fig. Suplementaria 4a). Sin embargo, un análisis similar de hojas comparables de las líneas transgénicas TaEPF1-OE indicó una disminución de la densidad estomática en la base de la hoja 5 (Supplementary Fig. 4b) que se reflejó en una disminución de la porosidad en esta región, como reveló el análisis de TC (Supplementary Fig. 4c). Para identificar mejor las regiones de la base de las hojas de trigo en las que la diferenciación estomática estaba comenzando, utilizamos la microscopía confocal para analizar la hoja 3 de plántulas de trigo en una fase relativamente temprana de desarrollo. Esto reveló que las regiones del extremo más distal de estas hojas se distinguían por tener complejos estomáticos maduros (Fig. 4a) subtendidos por espacios aéreos relativamente grandes (Fig. 4b, c). Por el contrario, en las regiones más proximales de la base, donde las células epidérmicas sometidas a los patrones de división característicos de la diferenciación estomática eran claramente visibles (Fig. 4d), aunque los espacios aéreos ocasionales eran visibles en los intersticios de algunas células subepidérmicas adyacentes (Fig. 4e), éstos eran mucho más pequeños que los observados en el tejido más proximal (Fig. 4b) y no mostraban ningún patrón evidente vinculado a los estomas diferenciados superpuestos (Fig. 4f).
Progresión del desarrollo de la diferenciación estomática y de la formación del espacio aéreo del mesófilo. a-f Imágenes confocales de la hoja 3 de plántulas de trigo (6n) tomadas en la región del extremo distal (a-c) o en la base proximal (d-f). Las imágenes son de la epidermis (a, d) o del mesófilo subyacente (b, e), con las paredes celulares coloreadas en falso y superpuestas en (c, f). Un estoma maduro es visible en a, con dos estomas inmaduros en d. Un gran espacio aéreo subtiende el estoma en a (indicado por asteriscos en b, c). En e y f se aprecian pequeños espacios de aire en las uniones celulares. g-l Imágenes confocales de hojas de Arabidopsis en su madurez (g-i) o en su desarrollo temprano (j-l). Las imágenes proceden de la epidermis (g, j) o del mesófilo subyacente (h, k), con la pared celular coloreada en falso y superpuesta en i, l. En el centro (g) se ve un estomato maduro, y en j numerosos estomatos en diversas fases de desarrollo. Debajo del estomato central (h) se ve un espacio aéreo relativamente grande (asteriscos), mientras que algunos espacios aéreos muy pequeños (asteriscos) se distribuyen en el mesófilo inmaduro (k, l) en las uniones celulares. Barra de escala c, f = 20 µm; i, l = 25 µm
Estos resultados apoyan la hipótesis de que la separación celular se produce en el mesófilo subepidérmico como parte de un programa endógeno de desarrollo, pero que el tamaño y la distribución de los espacios aéreos que finalmente se forman son promovidos por la presencia de estomas adyacentes y diferenciados. Los datos sugieren que existe un vínculo causal entre la densidad estomática y la porosidad general del mesófilo, y que el intercambio de gases y la porosidad del mesófilo están funcionalmente vinculados.
Para investigar los posibles impulsores fisiológicos de estos cambios, comparamos la tasa de asimilación fotosintética, la conductancia del mesófilo al CO2 (gm) y la eficiencia instantánea del uso del agua (iWUE) de las líneas de trigo con diferentes niveles de ploidía. Esto no reveló ninguna tendencia evidente que vincule la tasa de asimilación (Fig. 5a) o gm (Fig. 5c) con el nivel de ploidía, y ninguna correlación obvia de la tasa de asimilación con la porosidad del mesófilo (Fig. 5e). Por el contrario, las líneas de trigo 6n tuvieron un iWUE significativamente mayor que las líneas 2n y 4n (Supplementary Fig. 5b; ANOVA con Tukey posthoc, P = 0,0005 y P = 0,013, respectivamente). Esto se reflejó en una disminución de la superficie expuesta del mesófilo por volumen calculada a partir de nuestros análisis de TC (Fig. Suplementaria 5d), teniendo las líneas 6n valores significativamente más bajos en comparación con las líneas 2n (ANOVA con Tukey posthoc, P = 0,0001). Curiosamente, las mediciones del volumen de las células del mesófilo mediante microscopía confocal de luz revelaron un claro aumento con el nivel de ploidía (Fig. 5f suplementaria). Teniendo en cuenta la relación fija de la superficie con el volumen para formas similares, estos datos encajan con la hipótesis de que durante la selección del trigo moderno se ha producido un aumento del tamaño de las células del mesófilo, con la disminución concomitante de la superficie expuesta y la disminución de la porosidad del mesófilo, así como parámetros estomáticos alterados de mayor tamaño y menor densidad. Para investigar la posible relación causal entre la diferenciación estomática y la formación de espacios aéreos en el mesófilo, dirigimos nuestros análisis a las eudicotas, sometiendo a una serie de líneas transgénicas de Arabidopsis que previamente habían demostrado tener una densidad estomática alterada27 a un análisis combinado de microCT e intercambio de gases. Nos centramos en líneas en las que la sobreexpresión de EPF2 conduce a hojas con una densidad estomática significativamente menor (EPF2OE), y en las que la pérdida de EPF2 y su homólogo (EPF1) (mutante epf1epf2) genera hojas con una densidad estomática significativamente mayor25. En la Fig. 5a, b, d se muestran imágenes microCT de ejemplo para cada línea, con imágenes SEM de los estomas en la Fig. 5e, f, h y la confirmación del fenotipo de densidad estomática esperado en la Fig. 5i.
La porosidad de la mesofila está modulada por el intercambio de gases a través de los poros estomáticos. a-d Renderizaciones 3D de microCT de bloques de tejido (resolución = 2.75 μm; muestras = 1,1 mm2) y (e-h) imágenes SEM ejemplares de estomas de hojas de las líneas EPF2-OE, Col-0, focl1-1 y epf1epf2 de Arabidopsis (barras de escala = 10 μm). Se muestran las medias y la desviación estándar para (i) la densidad estomática (ANOVA, F(3,11) = 19,17, p < 0,0001), (j) la porosidad del mesófilo en empalizada (ANOVA, F(3,20) = 6,329, p = 0.0034) y (k) conductancia estomática, gs (ANOVA, F(3,20) = 26,22, p < 0,0001) para las líneas de Arabidopsis en a-d, con n = 6 excepto para la densidad estomática donde n = 4 (focl-1), n = 2 (EPF2-OE) y n = 3 (epf1epf2). Los datos de Col-0 son como en la ref. 13. Las líneas indicadas con la misma letra no pueden distinguirse entre sí en el límite de confianza p < 0,05 (Tukey posthoc). l La porosidad del mesófilo de la empalizada se traza contra la conductancia estomática, gs, para muestras de hojas individuales de las cuatro líneas de Arabidopsis, como se indica. Se presentan los resultados de la regresión lineal
Las hojas de las eudicotas (como las que se encuentran en Arabidopsis) son distintas de las hojas típicas de las monocotiledóneas (ejemplificadas por el trigo en este trabajo) en el sentido de que muestran característicamente dos regiones del mesófilo, la empalizada adaxial y las capas esponjosas abaxiales, que se distinguen por tener diferencias establecidas por el desarrollo en la forma de la célula y el espacio aéreo (porosidad)13. Seleccionando volúmenes de interés dentro de las hojas de las líneas de Arabidopsis, obtuvimos datos de porosidad distintos para las respectivas capas de empalizada y esponjosa. Aunque la comparación de los valores medios de la porosidad del mesófilo sugirió diferencias limitadas entre las líneas, esto reflejó principalmente la similitud en los valores de la porosidad del mesófilo esponjoso (Fig. Suplementaria 6). Por el contrario, la porosidad del mesófilo en empalizada (que está más fuertemente asociada con la eficiencia fotosintética que la porosidad del mesófilo esponjoso13) mostró mayores diferencias entre las líneas, siendo la empalizada epf1epf2 la de mayor porosidad (Fig. 4j), y la de mayor densidad estomática (Fig. 4i). Estos datos sugieren una situación más complicada en la hoja de Arabidopsis eudicótica en comparación con la hoja de trigo monocótica. Las manipulaciones que alteran la densidad estomática en Arabidopsis pueden conducir a alteraciones manifiestas en la porosidad del mesófilo, pero el resultado está dictado por la identidad del mesófilo (empalizada o esponjoso). Las observaciones se ajustan a una interpretación según la cual un patrón de desarrollo de la diferenciación del mesófilo se establece muy temprano en el desarrollo de la hoja (definiendo las capas de empalizada y esponjosa en las eudicotas)28,29 con la identidad del mesófilo estableciendo la escala de modulación de la porosidad por factores que ocurren más tarde en el desarrollo, tales como las señales asociadas con el patrón estomático. Además, como en el caso del trigo, un análisis de las primeras etapas de la diferenciación estomática apoyó la idea de que el grado y la extensión de la formación del espacio aéreo del mesófilo estaba modulado por la presencia de estomas maduros y diferenciados. Así, durante la fase de crecimiento de la hoja en la que se producían las divisiones de las células epidérmicas que daban lugar a los estomas (Fig. 4j), los espacios aéreos eran visibles en los intersticios de algunas células subepidérmicas (Fig. 4k), pero no había ninguna similitud evidente en el patrón de estos espacios aéreos y los estomas diferenciados subyacentes (Fig. 4l). En la etapa de desarrollo en la que los estomas completamente diferenciados eran visibles (Fig. 4g), había numerosos y grandes espacios de aire en todo el mesófilo de la empalizada subepidérmica (Fig. 4h), con los estomas siempre subtendidos por un espacio de aire (Fig. 4i).
Conductancia estomática y modulación del espacio aéreo del mesófilo
Nuestros datos tanto del trigo como de Arabidopsis apoyan la hipótesis de que la presencia de estomas modula el grado de porosidad del mesófilo. Sin embargo, nuestra observación de que la porosidad de la empalizada en la línea EPF2OE de Arabidopsis no es diferente de la de Col-0 (Fig. 5j), a pesar de la enorme disminución de la densidad estomática (Fig. 5i), sugiere que no se trata simplemente de un proceso directo en el que la diferenciación de las células de guarda conduce a un aumento/disminución proporcional de la separación de las células del mesófilo (como se ha sugerido7). Una hipótesis alternativa (aunque no exclusiva) es que el funcionamiento real de los estomas para permitir el intercambio de gases es un factor importante que vincula la densidad estomática y la porosidad del mesófilo. De hecho, nuestros datos del trigo muestran una fuerte correlación positiva entre la porosidad del mesófilo y la gs (Figs. 1l, 3i, j). Probamos esta hipótesis en Arabidopsis explotando un mutante estomático recientemente caracterizado, focl1-1, en el que los pasos finales de la formación de los salientes cuticulares de la guarda están interrumpidos30. Esto hace que la mayoría de los estomas formen poros que inicialmente están completamente cubiertos por una capa de lípidos/cutícula. A medida que maduran, la cutícula de aproximadamente el 10% de los estomas se desgarra, dando lugar inevitablemente a agujeros que deben permitir un grado limitado de intercambio de gases dentro y fuera de la hoja a través de las cavidades subestomáticas visibles que se forman. En la Fig. 5g se muestra un estomato focl1-1 parcialmente cubierto y puede compararse con los poros estomáticos abiertos observados en las hojas Col-0, EPF2OE y epf1epf2 (Fig. 5e-h). La presencia de poros estomáticos parcialmente cubiertos proporciona una herramienta útil para investigar hasta qué punto la porosidad del mesófilo está relacionada con el intercambio de gases. Un análisis combinado por pares de microCT e intercambio de gases de las cuatro líneas de Arabidopsis reveló una correlación positiva altamente significativa de gs y la porosidad de la empalizada (correlación de Pearson, r2 = 0,471, P = 0,0002; Fig. 5l), con los datos del mutante focl-1 agrupados por debajo de los del control Col-0 y a la par con las muestras EPF2OE. Cuando se considera la tasa de asimilación de las hojas individuales de las plantas mutantes con respecto a la porosidad de la empalizada, aunque existe una débil correlación (Fig. suplementaria 7a; correlación de Pearson, r2 = 0,289, P = 0,007), la relación de la porosidad con la eficiencia en el uso del agua es mucho más fuerte (Fig. suplementaria 7b; correlación de Pearson, r2 = 0,526, P = 0.0001), consistente con la hipótesis de que la restricción de la pérdida de agua puede ser el principal impulsor de los cambios observados en la estructura de la hoja.
En general, estas observaciones apoyan la idea de que, además de una potencial señal directa de las células de guarda diferenciadas, el funcionamiento real de los estomas para permitir el intercambio de gases desempeña un importante papel funcional en la promoción de los eventos de separación y crecimiento celular que, en última instancia, controlan la porosidad del mesófilo.