¿Cómo funciona la tecnología del ADN recombinante? El organismo en estudio, que se utilizará para donar ADN para el análisis, se llama organismo donante. El procedimiento básico consiste en extraer y cortar el ADN de un genoma donante en fragmentos que contengan de uno a varios genes y permitir que estos fragmentos se inserten individualmente en pequeñas moléculas de ADN abiertas que se replican de forma autónoma, como los plásmidos bacterianos. Estas pequeñas moléculas circulares actúan como portadoras, o vectores, de los fragmentos de ADN. Las moléculas vectoriales con sus insertos se denominan ADN recombinante porque consisten en combinaciones novedosas de ADN del genoma donante (que puede ser de cualquier organismo) con ADN vectorial de una fuente completamente diferente (generalmente un plásmido bacteriano o un virus). La mezcla de ADN recombinante se utiliza entonces para transformar células bacterianas, y es habitual que las moléculas de vectores recombinantes se introduzcan en células bacterianas individuales. Las células bacterianas se colocan en placas y se les permite crecer en colonias. Una célula individual transformada con un único vector recombinante se dividirá en una colonia con millones de células, todas ellas portadoras del mismo vector recombinante. Por lo tanto, una colonia individual contiene una población muy grande de inserciones de ADN idénticas, y esta población se denomina clon de ADN. Gran parte del análisis del fragmento de ADN clonado puede realizarse en la fase en que se encuentra en el huésped bacteriano. Sin embargo, más adelante suele ser conveniente reintroducir el ADN clonado en las células del organismo donante original para llevar a cabo manipulaciones específicas de la estructura y la función del genoma. Por lo tanto, el protocolo suele ser el siguiente:
Mensaje
La clonación permite la amplificación y recuperación de un segmento específico de ADN a partir de una muestra de ADN grande y compleja, como un genoma.
Como el ADN donante fue cortado en muchos fragmentos diferentes, la mayoría de las colonias llevarán un ADN recombinante diferente (es decir, un inserto clonado diferente). Por lo tanto, el siguiente paso es encontrar la forma de seleccionar el clon con el inserto que contiene el gen específico que nos interesa. Una vez obtenido este clon, se aísla el ADN a granel y el gen clonado de interés puede someterse a diversos análisis, que consideraremos más adelante en el capítulo. Hay que tener en cuenta que el método de clonación funciona porque las moléculas individuales de ADN recombinante entran en células huésped bacterianas individuales, y luego estas células hacen el trabajo de amplificar las moléculas individuales en grandes poblaciones de moléculas que pueden ser tratadas como reactivos químicos. La figura 12-1 ofrece un esquema general del enfoque.
Figura 12-1
La tecnología del ADN recombinante permite insertar fragmentos individuales de ADN de cualquier genoma en moléculas de ADN vectoriales, como plásmidos, y amplificarlos individualmente en bacterias. Cada fragmento amplificado se denomina clon de ADN.
El término ADN recombinante debe distinguirse de los recombinantes naturales de ADN que resultan del cruce entre cromosomas homólogos en botheucariotas y procariotas. El ADN recombinante, en el sentido que se utiliza en este capítulo, es una unión no natural de ADN de fuentes no homólogas, normalmente de diferentes organismos. Algunos genetistas prefieren el nombre alternativo de ADN quimérico, en honor al monstruo mitológico griego Quimera, que a lo largo de la historia ha sido el símbolo de una unión biológica imposible, una combinación de partes de diferentes animales. Del mismo modo, el ADN recombinante es una quimera de ADN y sería imposible sin la manipulación experimental que llamamos tecnología del ADN recombinante.
Aislamiento del ADN
El primer paso para hacer ADN recombinante es aislar el ADN donante y el vector.Los protocolos generales para el aislamiento del ADN estaban disponibles muchas décadas antes de laadvolución de la tecnología del ADN recombinante. Con el uso de estos métodos, la mayor parte del ADN extraído del donante será ADN genómico nuclear en eucariotas o ADN genómico principal en procariotas; estos tipos son generalmente los que se requieren para el análisis. El procedimiento utilizado para obtener el ADN del vector depende de la naturaleza del mismo. Los plásmidos bacterianos son los vectores más utilizados, y estos plásmidos deben purificarse lejos del ADN genómico bacteriano. En la Figura 12-2 se resume un protocolo para extraer el ADN plasmídico por ultracentrifugación. El ADN plasmídico forma una banda distinta después de la ultracentrifugación en un gradiente de densidad de cloruro de cesio que contiene bromuro de etidio. La banda del plásmido se recoge haciendo un agujero en el tubo de centrífuga de plástico. Otro protocolo se basa en la observación de que, a un pH alcalino específico, el ADN genómico bacteriano se desnaturaliza pero los plásmidos no. La posterior neutralización precipita el ADN genómico, pero los plásmidos permanecen en la solución.Los fagos como el λ también pueden utilizarse como vectores para clonar ADN en sistemas bacterianos. El ADN de los fagos se aísla a partir de una suspensión pura de fagos recuperada del lisado de los fagos.
Figura 12-2
Los plásmidos, como los que portan genes de resistencia al antibiótico tetraciclina (arriba a la izquierda), pueden separarse del ADN cromosómico bacteriano. Debido a que la unión diferencial del bromuro de etidio con las dos especies de ADN hace que el plásmido circular (más…)
Corte del ADN
El avance que hizo posible la tecnología del ADN recombinante fue el descubrimiento y la caracterización de las enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son producidas por las bacterias como mecanismo de defensa contra los fagos. Las enzimas actúan como tijeras, cortando el ADN del fago e inactivándolo, y lo que es más importante, las enzimas de restricción no cortan al azar, sino que cortan secuencias específicas de ADN, lo que es una de las características clave que las hace aptas para la manipulación del ADN. Cualquier molécula de ADN, desde la viral hasta la humana, contiene sitios objetivo de enzimas de restricción por pura casualidad y, por tanto, puede cortarse en fragmentos definidos de un tamaño adecuado para la clonación. Los sitios de restricción no son relevantes para la función del organismo, y no se cortarían in vivo, porque la mayoría de los organismos no tienen enzimas de restricción.
Veamos un ejemplo: la enzima de restricción EcoRI (deE. coli) reconoce la siguiente secuencia de seis pares de nucleótidos en el ADN de cualquier organismo:
Este tipo de segmento se denomina palíndromo de ADN, lo que significa que ambas cadenas tienen la misma secuencia de nucleótidos pero en orientación antiparalela.Muchas enzimas de restricción diferentes reconocen y cortan palíndromos específicos. La enzima EcoRI corta dentro de esta secuencia pero en un par de cortes escalonados entre los nucleótidos G y A.
Este corte escalonado deja un par de «extremos pegajosos» monocatenarios idénticos. Los extremos se llaman pegajosos porque pueden unirse por hidrógeno (pegarse) a una secuencia complementaria. La figura 12-3 muestra a EcoRI realizando un único corte en una molécula de ADN circular como un plásmido: el corte abre el círculo y la molécula lineal formada tiene dos extremos pegajosos. La producción de estos extremos pegajosos es otra característica de las enzimas de restricción que las hace adecuadas para la tecnología del ADN recombinante. El principio es simplemente que, si se cortan dos moléculas de ADN diferentes con la misma enzima de restricción, ambas producirán fragmentos con los mismos extremos pegajosos complementarios, haciendo posible la formación de quimeras de ADN. Por lo tanto, si tanto el ADN vectorial como el ADN donante se cortan con EcoRI, los extremos pegajosos del vector pueden unirse a los extremos pegajosos de un fragmento donante cuando los dos se mezclan.
Figura 12-3
La enzima de restricción EcoRI corta una molécula de ADN circular con una secuencia diana, dando como resultado una molécula lineal con extremos pegajosos monocatenarios.
Mensaje
Las enzimas de restricción tienen dos propiedades útiles en la tecnología del ADN recombinante. En segundo lugar, muchas enzimas de restricción realizan cortes escalonados que crean extremos pegajosos de una sola hebra que favorecen la formación de ADN recombinante.
En la actualidad se han identificado docenas de enzimas de restricción con diferentes especificidades de secuencia, algunas de las cuales se muestran en la Tabla12-1. Se observará que todas las secuencias objetivo son palíndromos, pero, como EcoRI, algunas enzimas realizan cortes escalonados, mientras que otras realizan cortes al ras. Incluso los cortes al ras, que carecen de extremos pegajosos, pueden utilizarse para hacer ADN recombinante.
Tabla 12-1
Sitios de reconocimiento, escisión y modificación de varias enzimas de restricción.
El ADN también puede ser cortado por cizallamiento mecánico. Por ejemplo, si se agita el ADN en una batidora, las moléculas largas del tamaño de un cromosoma se romperán en segmentos clonables con extremos al ras.
Unir el ADN
Lo más común es que tanto el ADN donante como el ADN vectorial se digieran con el uso de una enzima de restricción que produce extremos pegajosos y luego se mezclen en un tubo de ensayo para permitir que los extremos pegajosos del ADN vectorial y del donante se unan entre sí y formen moléculas recombinantes. La figura 12-4 muestra un vector de plásmido que lleva un solo sitio de restricción EcoRI; por lo tanto, la digestión con la enzima de restricción EcoRI convierte el ADN circular en una molécula lineal con extremos pegajosos. El ADN donante de cualquier otra fuente (por ejemplo, Drosophila) también se trata con la enzima EcoRI para producir una población de fragmentos con los mismos extremos pegajosos. Cuando las dos poblaciones se mezclan, los fragmentos de ADN de las dos fuentes pueden unirse, porque se forman dobles hélices entre sus extremos pegajosos. Por lo tanto, se producirá una gran variedad de vectores con diferentes insertos donantes. En esta etapa, aunque los extremos pegajosos se han unido para generar una población de moléculas quiméricas, las columnas vertebrales de azúcar-fosfato aún no están completas en dos posiciones en cada unión. Sin embargo, las espinas dorsales pueden sellarse mediante la adición de la enzima ADN ligasa, que crea enlaces fosfodiéster en las uniones (Figura 12-4b). Ciertas ligasas son incluso capaces de unir fragmentos de ADN con extremos romos.
Figura 12-4
Método para generar un plásmido de ADN quimérico que contiene genes derivados de ADN extraño. (De S. N. Cohen, «The Manipulation of Genes. «Copyright © 1975 by Scientific American, Inc. Todos los derechos reservados).
Amplificación del ADN recombinante
El ADN recombinante ligado entra en una célula bacteriana por transformación. Después de estar en la célula huésped, el vector plasmídico es capaz de replicarse porque los plásmidos normalmente tienen un origen de replicación. Sin embargo, ahora que el inserto de ADN donante es parte de la longitud del vector, el ADN donante se replica automáticamente junto con el vector. Cada plásmido recombinante que entra en una célula formará múltiples copias de sí mismo en esa célula. Posteriormente, se llevarán a cabo muchos ciclos de división celular y los vectores recombinantes se someterán a más rondas de replicación.La colonia de bacterias resultante contendrá miles de millones de copias del inserto de ADN mononormativo. Este conjunto de copias amplificadas del fragmento de ADN donante único es el clon de ADN (Figura 12-5).
Figura 12-5
Cómo funciona la amplificación. El tratamiento con enzimas de restricción del ADN donante y del vector permite la inserción de fragmentos individuales en los vectores. El vector único entra en un huésped bacteriano, donde la replicación y la división celular dan lugar a un gran número de copias del fragmento donante. (más…)