Resultados y discusión
Nuestro enfoque para evaluar la nucleación de la hélice utiliza α-hélices de enlace de hidrógeno (HBS) en las que el enlace de hidrógeno de la cadena principal N-terminal se sustituye por un enlace covalente (Fig. 1B) (20). En informes anteriores, describimos hélices HBS en las que el enlace de hidrógeno se sustituye por un enlace carbono-carbono (21). La caracterización de estas hélices sintéticas mediante espectroscopia CD y 2D-NMR, así como el análisis de difracción de rayos X de un solo cristal, revela que imitan fielmente la conformación de las α-hélices canónicas (21, 22). Es importante destacar que las hélices HBS son capaces de inhibir las interacciones intracelulares proteína-proteína mediadas por los dominios α-helicoidales, apoyando la hipótesis de que estos compuestos reproducen la estructura y función de las α-hélices proteicas (23, 24). Para analizar el efecto de diferentes residuos en la formación de α-hélices, preparamos un análogo de HBS con un enlace disulfuro cuyas tasas de formación podían ser monitorizadas en condiciones acuosas (25). Conjeturamos que las tasas de formación de este enlace proporcionarían una sonda única para examinar los parámetros biofísicos relacionados con la formación de hélices. Dado que el enlace disulfuro-HBS (dsHBS) imita el enlace de hidrógeno intramolecular en las α-hélices, planteamos la hipótesis de que la oxidación de bisthiol (bt) a disulfuro (ds) proporcionaría una medida directa de la nucleación de la hélice (Fig. 1C). Las tasas de formación de hélices para péptidos modelo se han medido mediante espectroscopias ultrarrápidas y caen en el rango de los nanosegundos (14, 26⇓⇓-29). Las tasas de formación de disulfuro son mucho más lentas (del orden de minutos) en nuestras condiciones de reacción (30). La escala de tiempo dramáticamente más lenta para la formación de disulfuro sugiere que las diferencias dependientes de la secuencia en la tasa de formación de disulfuro reflejan poblaciones de preequilibrio: los residuos con mayor propensión a la nucleación favorecen la formación de disulfuro.
Las hélices HBS enlazadas con disulfuro pueden derivarse de la oxidación de los péptidos bistilos parentales permitiendo un enfoque fácil para controlar la conformación del péptido (31⇓⇓-34). Basamos nuestro diseño inicial del péptido en un segmento corto del dominio de activación de p53: XQEG*FSDLWKLLS (1), donde X y G* representan los residuos restringidos por la dsHBS (35). Se eligió la secuencia de p53 porque tiene relativamente pocos contactos de cadena lateral, como los puentes iónicos, que pueden sesgar los resultados. Anteriormente hemos caracterizado una serie de análogos de la HBS de p53 mediante espectroscopias de CD y RMN, lo que nos ha permitido predecir posibles problemas de agregación que pueden afectar a las construcciones estabilizadas (36⇓-38). El péptido p53 bisthiol es débilmente helicoidal en tampones acuosos a 295 K. La espectroscopia CD (Fig. 2A) muestra que el p53 dsHBS 1 es altamente helicoidal en comparación con el péptido bt original (25). Seleccionamos A, G, D, I, K, L, P y V como residuos invitados para esta investigación. Esta selección incluye residuos alifáticos representativos de cadena recta y β-ramificados junto con cadenas laterales cargadas positiva y negativamente.
Análisis conformacional y síntesis de péptidos sin restricciones. (A) La espectroscopia de CD sugiere que el péptido HBS enlazado con disulfuro (ds) es altamente helicoidal en comparación con el bisthiol (bt) original. Los estudios de CD se realizaron con 50 μM de péptidos en 1 mM de PBS. (B) Estructuras derivadas de la RMN del ds-2A. Se muestran vistas de 20 estructuras de mínima energía con los átomos de carbono, nitrógeno y oxígeno en gris, azul y rojo, respectivamente. El enlace disulfuro se muestra en color amarillo. (C) Esquema de la reacción de oxidación. La conversión de bt-2Λ → ds-2Λ se vio afectada bajo condiciones oxidativas suaves; el bistiol no reaccionado se apagó con maleimida 3.
Tras los experimentos iniciales, el péptido 1 se modificó sustituyendo los residuos nativos de ácido glutámico y fenilalanina por lisina y alanina, respectivamente, para obtener 2Λ XΛKG*ASDLWKLLS. La nueva secuencia se diseñó para evitar posibles interacciones de cadena lateral entre los residuos huéspedes (Λ) y la posición i + 3 correspondiente; la lisina se incorporó para aumentar la solubilidad en agua del huésped. Se eligió la segunda posición para la introducción de huéspedes porque la conformación de este residuo está implicada en la inducción de la hélice cerca del extremo N (39, 40). La conformación helicoidal de ds-2A: XAKG*ASDLWKLLS se evaluó mediante una combinación de estudios de RMN 1D, espectroscopia de correlación total y espectroscopia de correlación de efecto Overhauser de marco giratorio (ROESY) en soluciones acuosas (Texto SI, Tabla S1 y Fig. S1). Los espectros ROESY revelaron picos cruzados de efecto Overhauser nuclear (NOE) indicativos de una estructura helicoidal, incluyendo NH-NH secuencial (i e i + 1) y varios NOE de mayor alcance (entre i e i + 3/i + 4) (Texto SI, Tabla S2). Es importante destacar que todos los ángulos diedros ϕ de la columna vertebral, calculados a partir de las constantes de acoplamiento 3JNHCHα, están en el rango esperado para las conformaciones helicoidales (Texto SI, Tabla S1) (41, 42). Las constantes de acoplamiento observadas para los residuos dentro del macrociclo no difieren del resto de la cadena, lo que indica que la restricción disulfuro está induciendo fielmente una conformación α-helicoidal. La estructura en solución de ds-2A se determinó a partir de 48 picos cruzados ROESY y 11 ángulos ϕ calculados utilizando la búsqueda conformacional Monte Carlo en Macromodel 2014. En la Fig. 2B se muestra una superposición de las 20 estructuras de menor energía para ds-2A. En particular, el macrociclo restringido por el disulfuro no perturba el extremo N de la α-hélice. En general, junto con la espectroscopia de CD, los estudios de RMN confirman la estabilización de una conformación α-hélica mayor en los péptidos restringidos por dsHBS.
Los péptidos bisthiol y HBS se sintetizaron como se muestra en el Texto SI, Fig. S2. Utilizamos condiciones de oxidación suaves consistentes en un 2% (vol/vol) de DMSO para oxidar los bistioles (Fig. 2C) (25, 30). Para separar los bistioles y los péptidos dsHBS estrechamente relacionados en la HPLC y para apagar los grupos tiol, tratamos la mezcla de reacción con un derivado de maleimida (43). La adecuada separación de los péptidos bisthiol y disulfuro en HPLC nos permitió cuantificar las tasas de formación de disulfuro para cada secuencia a partir del análisis de las áreas de los picos de HPLC (Fig. 3A y Fig. S3). Las tasas iniciales de formación de disulfuro se representan en la Fig. 3B, y los datos tabulados se presentan en la Tabla 1.
Análisis de la conversión de bistiol a disulfuro. (A) Las tasas de la conversión de bt ads se analizaron por HPLC, con triptófano como control interno. Se muestran los resultados representativos de la HPLC para el péptido 2 con alanina (Λ = A) como residuo invitado. (B) Gráficos de la conversión de bt a ds para diferentes residuos invitados. (C) Los espectros de CD de las secuencias con diferentes residuos invitados ilustran que el contenido helicoidal de la mayoría de las secuencias, con la excepción de las secuencias con Λ = G, P y D, es idéntico. Los estudios de CD se realizaron con 50 μM de péptidos en 5 mM de KF, pH 7,3.
- Ver inline
- Ver popup
Comparación de la tasa de formación de dsHBS con los valores de propensión a la hélice de la literatura
Las secuencias de leucina y alanina son similares en sus tasas de formación de disulfuro, como podría esperarse de los valores de propensión de la literatura (Tabla 1) (6). Estos resultados proporcionan métricas útiles para medir el potencial de nuestro modelo sintético como sonda de nucleación de hélices. Sorprendentemente, nuestras investigaciones revelan que los residuos β-ramificados no son perjudiciales para la nucleación de la α-hélice. De hecho, la tasa de formación de disulfuro con la valina es casi la misma que la de la alanina y la leucina, mientras que la isoleucina provoca una ligera disminución. Los residuos cargados, la lisina y el aspartato, reducen la velocidad de reacción al nivel de la glicina. Dado que el ácido aspártico es un conocido rompedor de hélices, mientras que la lisina se considera un residuo estabilizador de hélices (44, 45), estos resultados sugieren que los residuos cargados participan potencialmente en las interacciones de largo alcance. Aunque las secuencias de este estudio se diseñaron para minimizar la dependencia del contexto, no se pueden descartar por completo las interacciones de la columna vertebral. La espectroscopia CD muestra que cinco de las ocho secuencias dsHBS tienen un contenido helicoidal muy similar; la sustitución de glicina, prolina y ácido aspártico disminuye la helicidad (Fig. 3C). Conjeturamos que la estabilidad helicoidal de la secuencia restringida no es un determinante importante de la formación de la tasa de disulfuro. La comparación de las secuencias de lisina y ácido aspártico proporciona apoyo a esta hipótesis, porque estas secuencias muestran tasas similares de formación de disulfuro, mientras que los péptidos restringidos muestran diferentes estabilidades helicoidales. Los residuos cargados en el extremo de las hélices pueden influir positiva o negativamente en la estabilidad de la hélice en función de sus interacciones con el macrodipolo de la hélice (46). Sin embargo, dichas interacciones macrodipolares no deberían influir en el proceso de nucleación de la hélice porque ésta aún no está organizada.
Para obtener apoyo teórico a nuestras observaciones experimentales, calculamos las barreras de activación para la formación de un enlace de hidrógeno i a i + 4 en secuencias peptídicas utilizando simulaciones metadinámicas (47, 48). Las transiciones hélice-bobina se han investigado previamente utilizando simulaciones de dinámica molecular para analizar la propensión a la hélice y las escalas de tiempo de nucleación, pero, hasta donde sabemos, el efecto de las mutaciones puntuales en la nucleación de la hélice no se ha explorado sistemáticamente (28, 39, 49). Determinamos el impacto de diferentes residuos en la formación de un giro α en una secuencia peptídica modelo acetilada y metilada, Ac-AΛA-NHMe. Utilizamos la distribución de Schrodinger 2012 de Desmond 3.1 (50) para realizar una simulación metadinámica de 50 ns en el tripéptido utilizando el campo de fuerza Amber ff12SB y los parámetros de iones monovalentes asociados (51, 52). Se determinaron superficies bidimensionales de energía libre y se identificaron las energías de activación por inspección (Fig. 4). Las energías de activación se estabilizan a medida que aumenta la longitud de la simulación, lo que sugiere que la simulación convergió a los 15 ns (Fig. S4). También realizamos las simulaciones por triplicado y medimos la media rmsd entre las superficies de energía libre resultantes (Fig. S4). El análisis revela que todos los residuos invitados (Λ), excepto la prolina, muestran ángulos diedros correspondientes a las regiones de la hélice α, la hebra β y la poliprolina II (PPII) de la trama de Ramachandran (Fig. 4A). El gráfico del tripéptido que contiene prolina sólo presenta los mínimos α y PPII (Fig. 4B). Los gráficos para los otros 18 residuos invitados en Ac-AΛA-NHMe se muestran en la Fig. S5. La fracción ponderada de las poblaciones α, β y PPII para los diferentes residuos invitados se representa en la Fig. 4C. Para calcular la barrera para la formación de hélices, comparamos la altura del pico más corto entre la cuenca de energía más baja correspondiente a los ángulos diedros PPII o β con el diedro α-helicoidal para cada residuo (Fig. 4D). Los ángulos diedros PPII resultaron ser la conformación de menor energía para la mayoría de los residuos invitados en nuestros cálculos.
Resultados de la simulación metadinámica para evaluar la barrera a la formación de un enlace de hidrógeno i a i + 4 en un péptido modelo (AcAΛA-NHMe) en función de diferentes residuos invitados. (A y B) Se muestran las superficies bidimensionales de energía libre para Λ = alanina y prolina con los demás incluidos en el texto del SI. Los gráficos de Ramachandran de todos los residuos muestran cuencas de baja energía para los espacios diédricos α, β y poliprolina II (PPII), con la excepción de la prolina, donde dominan los espacios PPII y α. (C) Poblaciones ponderadas de todas las cuencas de baja energía correspondientes a los ángulos diedros α, β y PPII. (D) La barrera de energía de activación entre la región de menor energía correspondiente al espacio PPII y los ángulos diédricos α-helicales.
Los resultados de estos cálculos se correlacionan con los datos experimentales y sugieren que la barrera de preorganización de la conformación α-helical no sigue escalas de propensión. Aunque las energías de activación reflejan poblaciones de partida y perfiles energéticos de las conformaciones α y β o PPII, proporcionan un indicador para estimar la dificultad dependiente de los residuos para adoptar una conformación α-helical. Los valores calculados de ∆G‡ identifican residuos invitados con tasas de plegamiento rápidas y lentas, pero sugieren que las tasas de varios otros no son fácilmente distinguibles. En general, los cálculos apoyan las observaciones experimentales de que las escalas de propensión helicoidal no son aplicables a la nucleación de hélices.