No se conoce completamente cómo las proteínas Rb controlan la proliferación celular. Se ha establecido que la proteína RB se asocia con una amplia variedad de factores de transcripción y complejos asociados a la cromatina.
La unión de la proteína Rb inhibe la capacidad de activación transcripcional de los factores E2F, enmascarando el dominio de activación transcripcional y, en algunos casos, convirtiendo los factores E2F en represores de la transcripción. La importancia de la interacción Rb-E2F en el control del crecimiento celular queda demostrada por el hallazgo de que todos los mutantes naturales de Rb aislados de tumores humanos carecen de la capacidad de unirse y regular negativamente a E2F (Qian et al., 1992).
Se cree que las proteínas Rb inhiben la expresión de los genes regulados por E2F de dos maneras (Dyson et al., 2002): uniéndose directamente y bloqueando el dominio de activación de las proteínas E2F o mediante la represión activa a través del reclutamiento de HDAC, factores SWI/SNF, proteínas del grupo Polycomb (Dahiya et al., 2001) o metiltransferasas (Vandel et al., 2001).
Unión a factores de transcripción E2F
La familia de factores de transcripción E2F está formada por al menos siete miembros de la familia E2F, E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5, 2A7E y E2F7.
Un factor de transcripción E2F funcional consiste en un heterodímero que contiene un polipéptido E2F y un polipéptido DP (Helin et al, 1993). Cada uno de los polipéptidos E2F puede heterodimerizarse con DP1 o DP2 (DP3) (Ormondroyd et al., 1995), aunque el factor de transcripción E2F7 se une al ADN de forma independiente de DP.
Existen diferencias funcionales y estructurales dentro de la familia E2F. E2F1, E2F2 y E2F3 son activadores transcripcionales, que interactúan con pRB. E2F4 y E2F5 son represores transcripcionales y se unen principalmente a Rb2/p130 y p107 (Gaubatz et al., 2000). El 2A7E parece no tener un dominio de interacción con proteínas de bolsillo; interactúa con proteínas Polycomb y reprime la transcripción (Morkel et al., 1997). También se cree que los recientemente identificados E2F7 y E2F8 reprimen promotores específicos (Di Stefano et al., 2003). La pareja de heterodimerización DP no parece determinar la especificidad de unión de los factores E2F a las proteínas de bolsillo. Sin embargo, los factores DP sí funcionan en la estabilización de la interacción entre los factores E2F y las proteínas Rb (Helin et al., 1993).
Durante la respuesta a la proliferación celular, hay una expresión diferente de los distintos E2F, presentando un aumento de E2F3 a principios de G1 hasta mediados de G1 y con E2F1 y E2F2 aumentando en el límite G1/S (Johnson et al., 1998). E2F4 y E2F5 se expresan a lo largo del ciclo celular, pero en G0 y G1 temprano, se unen al núcleo por p107 y Rb2/p130, formando complejos represores transcripcionales. p107 y Rb2/p130 reclutan a E2F4 en el núcleo de la célula, induciendo la represión de la transcripción de los genes de la fase S y la proliferación celular. Mientras tanto, se cree que pRb se une a E2F1-3 en los promotores que responden a E2F o los secuestra (De La Luna et al., 1996).
Después de la estimulación, las células quiescentes entran en el ciclo celular, y en la fase G1 temprana, pRb se fosforila y, en consecuencia, se liberan los factores transcripcionales E2F1-3, mientras que sólo a mediados de G1 hasta finales de G1, podemos observar la pérdida de los complejos Rb2/p130. Por lo tanto, en la fase G1 tardía, las proteínas Rb se fosforilan y se disocian de los E2F; los E2F4 y E2F5 se mueven al citoplasma y los E2F1-3 se unen a los promotores que responden a los E2F en sitios que a menudo son diferentes del sitio de unión de las proteínas represoras E2F (Cinti et al., 2000). En la transición de la fase G1/S, todavía se pueden detectar complejos que contienen p107 en asociación con E2F4 (Mudryj, 1991). Estos complejos E2F4-p107 también contienen ciclina E o A y cdk2 (Shirodkar, 1992). También se ha demostrado que los complejos E2F-p130 se acumulan, a medida que algunos tipos celulares, incluidos los mioblastos y los melanocitos, sufren una diferenciación terminal (Shin et al., 1995).
La pRb y las proteínas relacionadas p107 y Rb2/p130 no tienen una función totalmente redundante en la regulación de la transcripción de los genes E2F; en cambio, muestran una gran redundancia a nivel del ciclo celular. Por ejemplo, en los fibroblastos pRb-/- se produce un aumento compensatorio de los niveles de proteína p107 durante la detención en la fase G0/G1 (Sage et al., 2003). Se desconoce el mecanismo de este efecto antiproliferativo de p107 – p107 podría sustituir a pRb en la regulación de E2F1-3 o podría reprimir algunos genes sensibles a E2F que son controlados por pRb (Lee et al., 2002). Además, pRb también puede unirse a E2F4 in vitro, pero no regula el promotor que responde a E2F en células p107-/ y p130-/. Se ha demostrado que el complejo pRb-E2F4, en las células p107-/-, no consigue unirse a los mismos sitios promotores que suelen estar unidos por el complejo p107-E2F4 en las células de tipo salvaje (Rayman et al., 2002).
Sin embargo, pRb participa en la represión de un conjunto limitado de genes E2F en las células G0 y G1, y recientemente se ha definido su papel en la represión del gen de la ciclina E. De hecho, el promotor de la ciclina E está desregulado en las células que han perdido pRb, a pesar de que el complejo p107/p130-E2F4 sigue estando disponible (Herrera et al., 1996). pRb media la represión del promotor de la ciclina E mediante el reclutamiento de la HDAC y la histona metiltransferasa en un sitio particular de E2F-SP1 que está exclusivamente unido por los complejos pRb-E2F1-3. La ciclina E se despresiona no sólo por la pérdida de pRb sino también por la pérdida de las proteínas E2F1-3, por lo que está claro que las proteínas E2F1-3 actúan en este caso como represores en lugar de activadores (Wu et al., 2001). p107 o Rb2/p130 pueden sustituir a pRb sólo si están presentes en una cantidad suficiente para unirse a las proteínas E2F1-3 (Lee et al., 2002).
pRb puede inhibir la proliferación a través de un mecanismo independiente de E2F. Por ejemplo, pRb puede inducir la formación de cuerpos nucleares de leucemia promielocítica (PML) (Fang et al., 2002), aumentar la expresión de p27 (ver arriba), suprimir la señalización de Ras (Lee et al., 2002) y cooperar con hLin-9, una proteína que está implicada, de forma similar a pRb, en la supresión de la transformación pero de forma independiente de E2F (Gagrica et al., 2004).
Los complejos represores RB/E2F también pueden ser regulados de forma independiente de Cdk. Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante-β recluta a E2F4/p107 y E2F5/p107 por el promotor de c-myc independientemente de la fase celular, y sigue siendo estable en presencia de una alta actividad de Cdk (Chen et al., 2004). En las células humanas, se ha observado que p107 y p130 se eliminan de los promotores de los genes regulados por el ciclo celular durante la fase S, pero siguen localizados en los promotores de los genes apoptóticos (Young et al., 2004). La regulación del complejo RB/E2F de forma independiente de Cdk aún no se conoce bien.
Unión a proteínas que modifican la estructura de la cromatina
La represión por parte de las proteínas Rb requiere los dominios conservados A y B de la proteína de bolsillo y parece implicar la asociación de otras proteínas además de los factores E2F. Las proteínas Rb reprimen la transcripción mediante la remodelación de la estructura de la cromatina a través de la interacción con proteínas como hBRM, BRG1, HDAC1 y SUV39H1 (Shao et al., 1995), que participan respectivamente en la remodelación del nucleosoma, la acetilación/desacetilación de las histonas y la metilación.
HBRM y BRG1 son homólogos en mamíferos de los componentes del complejo de remodelación de la cromatina de la levadura SNF2/SWI2 (Strober et al., 1996). Se ha demostrado que tanto BRG1 como hBRM se asocian con pRB y están implicados en la represión mediada por pRb. No se requiere una interacción física entre pRb y BRG1 para la detención del crecimiento inducida por pRB y la represión transcripcional de los genes diana del E2F (Kang et al., 2004).
La histona desacetilasa 1 es una HDAC que recientemente ha demostrado ser reclutada a los complejos E2F por pRb y funcionar en la represión de la expresión génica de la ciclina E (Magnaghi-Jaulin et al., 1998). Las histonas suelen estar hiperacetiladas en los promotores de los genes transcritos activamente, pero están hipoacetiladas en los genes silenciados. La histona desacetilasa suele ser reclutada en los promotores de los genes por muchos reguladores transcripcionales. La pRB se asocia con la actividad de las HDAC in vivo y se une a las HDAC de clase I (HDAC1-HDAC3) in vitro. La represión mediada por pRB es potenciada por HDAC1 en experimentos de transfección transitoria, y para confirmar esta asociación entre pRb y HDAC, se ha demostrado que la inhibición de la actividad HDAC con tricostatina A interfiere con la represión mediada por pRB en un subconjunto de promotores regulados por E2F (Zhang et al., 2000). Por tanto, la histona desacetilasa está implicada en la modulación de la actividad represiva de pRb sobre los promotores del gen E2F. El reclutamiento de HDAC puede ser indirecto y estar acompañado por el reclutamiento de otras proteínas de unión como RBP1, corepresores y proteínas de remodelación de la cromatina (Lai et al., 1999). Rayman et al. (2002) han demostrado que en las células Rb-/-, la HDAC se encuentra en los promotores de los genes E2F; esto nos permitió hipotetizar que la pRb no es estrictamente necesaria en la represión transcripcional del E2F, sino que podrían estar implicados otros mecanismos. Las proteínas acetiltransferasas de histonas (CCBP, p300, Tip6, etc.) participan en la activación de las proteínas E2F (Condorelli y Giordano, 1997); interactúan con el dominio de activación de las proteínas E2F y estimulan su activación.
SUV39H1 es una metiltransferasa que metila específicamente K9 de la histona H3 y coopera con pRb en la represión del promotor de los genes que responden a E2F. En las células que carecen de pRB, no hay asociación de me-K9-H3 en estos promotores (Rea et al., 2000); en particular, estos resultados se han desarrollado estudiando la ciclina E, uno de los mejores genes diana de E2F modulados por pRb. Tanto pRb como SUV39H1 están directamente implicados en la represión de la transcripción de la ciclina E, ya que tanto en las células pRb-/- como en las SUV39H1-/- de doble knockout, la ciclina E está sobreexpresada. Las proteínas Rb también son capaces de impedir el ensamblaje de los complejos de preiniciación, inhibiendo la actividad de los factores de transcripción reclutados en los promotores de los genes E2F (Ross et al., 1999).
El tipo de represión que las proteínas Rb ejercen sobre el crecimiento celular depende del tipo de proteínas corepresoras que se unen a los genes diana del E2F. Por ejemplo, diferentes tipos de represión transcripcional pueden operar en el mismo promotor en un estado celular diferente o en un fenotipo celular distinto (Dimova y Dyson, 2005).
El complejo pRb/E2F también puede promover una represión estable independientemente de la posición en el ciclo celular o siendo resistente a la progresión del mismo. Desgraciadamente, los mecanismos a través de los cuales pRb participa en procesos que reprimen permanentemente la transcripción dependiente de E2F no son bien conocidos hasta ahora. Por ejemplo, E2F4 puede encontrarse en promotores regulados por E2F en fase S, pero no está claro si actúa como activador. Las células senescentes, por ejemplo, muestran un mayor nivel de metilación de H3K9 en los promotores que responden al E2F en comparación con las células quiescentes (Narita et al., 2003). Las proteínas Rb median en los genes que responden al E2F tanto en estado quiescente como senescente/diferenciado, caracterizándose el primero por bajos niveles de metilación de H3K9, y el segundo por altos niveles de metilación de H3K9. La identidad de la histona metiltransferasa que se recluta en el promotor también puede modular la transición entre una célula quiescente y una célula senescente/diferenciada.