Root Hair Sizer: an algorithm for high throughput recovery of different root hair and root developmental parameters

Material vegetal, condiciones de cultivo y tratamientos radiculares

Las plántulas de Medicago truncatula-R108 de tipo silvestre, utilizadas para este estudio, se cosecharon en 2008 en el INRA-Montpellier, Francia, y se conservaron a – 20 °C en un tubo en el que el espacio vacío se rellenó con algodón hidrófilo para reducir la humedad. Las semillas se escarificaron ligeramente con papel de lija (grano P80) y luego se esterilizaron en superficie 30 minutos bajo agitación en una solución preparada disolviendo 1/4 de una pastilla de lejía comercial en 250 mL de agua complementada con 30 µL de detergente. A continuación, las semillas se lavaron a fondo tres veces en agua estéril bajo flujo laminar. Si el detergente seguía presente, se realizaron pasos de lavado adicionales. Tras el último lavado, las semillas se mantuvieron 1 hora en agua a temperatura ambiente para su imbibición. Se eliminó el exceso de agua y las semillas se distribuyeron al azar en medio acuoso con 1% de agar (HP 696-Kalys). Las placas se colocaron boca abajo a 4 °C en la oscuridad durante 3 o 4 días de estratificación. Por último, la germinación se realizó a temperatura ambiente en la oscuridad durante toda la noche, manteniendo las placas boca abajo para permitir un crecimiento recto de las raíces fuera del agar, y para facilitar la transferencia posterior en un nuevo medio de cultivo. A continuación, las plántulas se cultivaron en medio Fahraeus modificado solidificado con 1,3% de Agar (HP 696-Kalys) (medio Fahraeus modificado: CaCl2 1 mM, MgSO4 0,5 mM, KH2PO4 0,7 mM, Na2HPO4 0,8 mM, Fe EDTA 50 μM, 0,1 mg/L de cada uno de los siguientes microelementos: MnSO4, CuSO4, ZnSO4, H3BO3 y Na2MoO4, pH ajustado a 7,5 con KOH) . Se transfirieron un máximo de 8 plántulas con raíces de alrededor de 1 cm por placa Petri cuadrada (12 cm × 12 cm) que contenía el medio de cultivo cubierto por un papel absorbente inerte (Mega International-USA) para evitar la penetración de las raíces. Durante la transferencia, se añadieron 125 µl de agua Milli-Q estéril a cada raíz para evitar que se secara antes de cerrar las cajas con cinta Millipore. Se utilizaron bolsas negras para cubrir la parte inferior del plato con el fin de proteger las raíces de la luz. Por último, los platos se colocaron con un ángulo de unos 45° respecto a la vertical en salas de cultivo que mantenían las condiciones de 24 °C, 60% de humedad y 16 h de iluminación.

Para probar el algoritmo RHS, las raíces se sometieron a diferentes tratamientos. Un primer conjunto de plantas no tratadas se cultivó durante 3 días después de la transferencia, antes de obtener imágenes de sus raíces bajo el microscopio. Para las condiciones tratadas, 2 días después de la transferencia, se abrieron los platos y se colocaron horizontalmente para añadir 20 mL de soluciones de tratamiento compuestas por 10 nM de factor Nod (NF), o 10 µM de ácido indol-3-acético (IAA) diluido en agua Milli-Q estéril. Como control, las plantas fueron tratadas con Milli-Q estéril. Después de 1 h de inmersión de las raíces, se eliminó el exceso de líquido, y los platos se cerraron y se volvieron a colocar en la sala de cultivo durante 18 h.

Las semillas de Arabidopsis thaliana (Col0) se esterilizaron en la superficie durante 3 h con gas de cloro producido al mezclar 3 mL de HCl 37% con 50 mL de hipoclorito de sodio 10%. Las semillas se esparcieron en una placa cuadrada (12 cm × 12 cm) llena de medio 1/2MS gelificado con 0,8% de agar vegetal (Duchefa). El plato se almacenó durante 2 días en la oscuridad a 4 °C para la estratificación y luego a 21 °C, 16 h de iluminación para la germinación y el cultivo. Después de 9 días, las plántulas se utilizaron para la adquisición de imágenes.

Las semillas de Brachypodium distachyon (Bd21-3) se despegaron de la cáscara con unas pinzas, luego se esterilizaron durante 15 min en un balancín en 1 mL de tampón de esterilización (20% de lejía doméstica, 0,1% de Tween20) y se enjuagaron 4 veces en agua bidestilada. Las semillas se depositaron en un plato cuadrado (12 cm × 12 cm) lleno de 1/2MS suplementado con 1% de agar, con el polo embrionario del eje largo de la semilla apuntando hacia abajo. Después de 2 días de estratificación a 4 °C, los platos se transfirieron y se colocaron verticalmente en una cámara de crecimiento a 28 °C y 16 h de iluminación para la germinación. Las plántulas estaban listas para la obtención de imágenes 3 días después de la germinación.

Adquisición de imágenes

Antes de describir en detalle los diferentes pasos del método, en el archivo adicional 2 se resume todo el proceso que abarca la obtención de imágenes, el análisis de Fiji Script, la clasificación de datos y el ajuste sigmoide: Figura S6.

Tres días después de la transferencia a la cámara de crecimiento (es decir, 18 h después de los tratamientos específicos, si es el caso), se extirparon las raíces de los órganos aéreos y se colocaron entre el portaobjetos y el cubreobjetos en medio líquido Fahareus. Se utilizó un microscopio de campo brillante (Leica DMI6000 con platina motorizada x, y, z. Software LAS, lámpara halógena Leica, objetivo seco de 5× con apertura numérica de 0,15, cámara Hamamatsu Orca ER-1395) para adquirir imágenes con una resolución de 19.703 ppi. La anchura de la RH está cubierta por una media de 10 píxeles. Se utilizó la platina motorizada del microscopio y las facilidades de reconstitución de mosaicos del software LAS para adquirir y reconstituir todas las imágenes analizadas (hay herramientas análogas disponibles libremente en ImageJ y Fiji ). La selección precisa de la terminación de la zona radicular a adquirir no es necesaria, ya que esta selección se normalizará posteriormente con el modelo sigmoidal. Para obtener imágenes nítidas de las HRs a lo largo de la raíz, se adquirieron pilas Z de cinco imágenes espaciadas por 100 µm.

Las imágenes de campo claro de las raíces de Arabidopsis se obtuvieron con una resolución de 15.631 ppi colocando la caja de cultivo abierta directamente bajo un estereoscopio Nikon SMZ18, equipado con un objetivo Nikon SHR Plan Apo WD:71 de 0,5×, zoom 8 y cámara Hamamatsu C11440. Se adquirieron tres posiciones XY por raíz moviendo manualmente la caja bajo el campo de visión para que dos imágenes consecutivas se superpusieran. No fue necesario el apilamiento en Z.

Las plántulas de Brachypodium fueron fotografiadas entre portaobjetos y cubreobjetos llenos de agua, manteniendo las hojas al descubierto del cubreobjetos. Las imágenes se adquirieron con el mismo sistema óptico que para las plántulas de Arabidopsis, con un aumento final de 40×. Se adquirieron dos posiciones XY por raíz para que se superpusieran dos imágenes consecutivas. No fue necesario el apilamiento en Z.

Las imágenes XY obtenidas para Arabidopsis y Brachypodium se cosieron en Fiji utilizando el plugin 2D Stitching . Si el solapamiento de la imagen no era suficiente para que 2D Stitching funcionara correctamente, la costura se ejecutó manualmente utilizando el plugin MosaicJ .

Root Hair Sizer: procesamiento de imágenes

Todo el procesamiento de imágenes se realizó utilizando el software de código abierto Fiji, pero también se puede lograr en el software de código abierto ImageJ con los plugins AnalyzeSkeleton y Auto_Threshold instalados . Como punto de partida, se requiere una sola imagen en la que se centren todos los RH. Aquí, generamos proyecciones Z sumando cinco cortes adquiridos, pero se puede emplear cualquier método de adquisición y procesamiento que produzca una sola imagen nítida de los RHs a lo largo de la raíz.

El resto del procesamiento se puede aplicar ejecutando el algoritmo RHS disponible en el archivo adicional 1: Script 1. Un resumen de todos los pasos del algoritmo también está disponible en la Tabla 1 y se ilustra en las Figs. 2 y el archivo adicional 2: Fig. S5. El archivo adicional 5: Película 1 está disponible adicionalmente para aclarar la comprensión de la interfaz. La primera parte del procesamiento de RHS consiste en la detección del área de RHs. El método, inspirado en Inoue et al. , consiste en el umbral de intensidad de los píxeles. Un primer proceso detectará el contorno de las RHs, mientras que un segundo procesa sólo el contorno de la raíz. Para evitar la definición manual del umbral de intensidad de los píxeles, se utilizó un umbral automatizado. La detección de la raíz con los RHs se logró mediante el método Bernsen, mientras que el eje de la raíz solo se detectó mediante el método Phansalkar (Archivo adicional 2: Fig. S7 y Tabla 1-pasos 3 y 4) . Para suavizar y rellenar los huecos de ambas imágenes binarias generadas, se aplicaron varios pasos de dilataciones y erosiones de píxeles (Tabla 1-pasos 3.2 y 4.2). A continuación, la imagen del eje de la raíz se sustrajo de la imagen completa de la raíz (raíz con SR) (archivo adicional 2: Fig. S7 y Tabla 1-paso 5) para obtener la superficie cubierta sólo por los SR. El ruido de fondo se borró en el paso 5.2 (Tabla 1-paso 5.2).

Como los pasos posteriores requieren que la raíz sea recta, la línea media de la raíz (RML) se recupera como el camino más largo del esqueleto obtenido de la imagen del eje de la raíz después de ejecutar los comandos ‘Skeletonize’ y ‘Analyse Skeleton (2D/3D)’ (Archivo adicional 2: Fig. S7 y Tabla 1-pasos 8.1 y 8.2). A continuación, la imagen RML se convierte en una selección polilineal (pasos 8.3 y 8.4), y se endereza con el comando Fiji ‘Straighten’ (archivo adicional 2: Fig. S7 y Tabla 1-paso 10). Dado que ‘Straighten’ genera una imagen con niveles de gris, se implementa una binarización adicional (Tabla 1-pasos 11 y 12). En la imagen final, los píxeles RH tienen un valor de 1, y los píxeles de fondo un valor de 0.

Calibrador de pelo de raíz: Medición de la longitud de la RH

La medición de la longitud del pelo de la raíz se realiza en dos pasos, como se detalla en la sección «Resultados» (Fig. 2). Primero, se desliza una selección rectangular a lo largo del eje de la raíz de la imagen enderezada y binarizada de los RH, midiendo la altura «L» de la superficie de los RH dentro de la selección en cada paso (Tabla 1-pasos 14.1 a 14.3) con la fórmula (1). En segundo lugar, se filtró un número determinado (normalmente 10) de valores L individuales consecutivos para obtener un valor Lmax como estimación de la longitud del SR (Tabla 1-pasos 14.4 a 14.5). Cada valor Lmax se asocia con una distancia correspondiente desde la punta de la raíz y se escribe en una tabla.

Calibrador de pelo de la raíz: ajustes ajustables

Dependiendo del tipo de raíz y de las propiedades de la imagen adquirida, puede ser necesario ajustar algunos parámetros. Los pasos ajustables están resaltados con varios asteriscos en el script RHS, mientras que los ajustes que empleamos en los ejemplos de Medicago mostrados están listados en la Tabla 1. Al umbralizar la imagen, el valor del radio para los métodos de umbralización de Bernsen y Phansalkar puede adaptarse, por ejemplo, para imágenes de diferente resolución, así como el número de erosiones y dilataciones aplicadas directamente después. Si el perfil del pelo de la raíz y el tipo de montaje óptico utilizado para la adquisición son muy diferentes del ejemplo presentado aquí, se anima a los usuarios a personalizar la estrategia de umbralización para adaptarla a su propia configuración. En el caso de las raíces de Arabidopsis, por ejemplo, se utilizó el método de umbralización de Phansalkar en lugar de Bernsen en el paso 3 para detectar la forma de la HR, mientras que en el paso 4 se utilizó el método de umbralización de Bernsen en lugar de Phansalkar para detectar la forma de la raíz. Además, el paso 5 ya no era necesario (Archivo adicional 4: Guión 4). El proceso de esqueletización de la raíz también podría necesitar algunos ajustes. La cantidad de simplificación de la polilínea que resalta la línea media de la raíz obtenida después de los comandos ‘Skeletonize’ y ‘Analyse Skeleton (2D/3D)’ puede ajustarse para imágenes mucho más grandes o pequeñas. Por último, en el proceso de enderezamiento, es importante ajustar la anchura de la polilínea para que cubra todas las RHs.

Cuando se ejecuta RHS, un cuadro de diálogo permite al usuario seleccionar el segmento de la raíz a analizar. La anchura w de la selección de análisis puede ajustarse de forma que sea ligeramente más fina que un SR (de 1/2 a 2/3). Por último, también puede adaptarse el tamaño del intervalo en el que debe elegirse Lmax. Un intervalo de 10 selecciones para recoger Lmax pareció preciso en los ejemplos mostrados aquí. El efecto de la variación de este parámetro, que regula la cantidad de puntos de datos retenidos frente a la variabilidad de los datos debido, por ejemplo, a los «agujeros» en el perfil de HR, se ilustra en el archivo adicional 2: Fig. S8).

Root Hair Sizer también propone anotar la imagen si algunas partes de la raíz deben ser eliminadas del análisis. La posición de estos comentarios a lo largo de la raíz se recuperan en la tabla final a través de la anotación de cada punto de datos como 1 y 0 (respectivamente la presencia y ausencia del comentario en este punto) en columnas separadas. Además, en varios pasos RHS permite al usuario comprobar y eventualmente corregir manualmente el proceso automático realizado por el algoritmo. Todas las definiciones automáticas y las correcciones manuales se registran y guardan como región de interés (ROI). Después de ejecutar RHS una primera vez, es posible analizar otra región de la raíz utilizando la ROI asociada a la imagen original empleando el script presentado en el archivo adicional 6: Script 2. Para ejecutar este script, es importante utilizar el mismo ancho de RML y llenar el primer cuadro de diálogo con los mismos nombres de comentarios utilizados con el algoritmo principal de RHS.

Procesamiento de datos

Los datos recogidos con RHS se clasifican con el software de hoja de cálculo Excel. Para todos los resultados presentados, se eliminaron del análisis las regiones que presentaban un artefacto (por ejemplo, una burbuja o polvo). En algunas imágenes, un lado de la raíz presentaba una HR menor a lo largo de toda su longitud en comparación con el otro lado, sobre todo en el caso de las raíces que crecían una al lado de la otra. En estos casos, sólo se mantuvo para el análisis el lado con mayor HR. En las leyendas de las figuras o en el texto se mencionan otros datos o parámetros específicos. Como se ha descrito anteriormente en «Resultados», para ajustar con precisión los puntos de datos se procedió a realizar dos ajustes sigmoides sucesivos. Entonces, como se examina en las Figuras 3b, Archivo adicional 2: Figs. S3, S4, obtuvimos una buena estimación de la sección de la curva que alberga una forma sigmoidea.

Los datos se ajustaron con la curva sigmoidea \a(f\a izquierda( d \a derecha)\a)

Este primer ajuste proporciona el punto de inflexión d50_1 y la longitud de extensión δ_1. A continuación, establecemos los límites para el segundo ajuste entre d50_1 ± 5δ_1.

El ajuste sigmoidal se logró utilizando el software GraphPad Prism. Los datos obtenidos de cada imagen fueron tratados por separado. Se ha aplicado un ajuste por mínimos cuadrados utilizando las siguientes reglas para definir los valores iniciales del ajuste para cada imagen considerada: