Resumen
Antecedentes. Anteriormente, descubrimos que las mujeres con anticuerpos anticéntricos positivos mostraban un potencial deteriorado de maduración de ovocitos y escisión de embriones; el posible mecanismo detrás de este fenómeno era aún desconocido. Objetivo. Por lo tanto, el presente estudio tenía como objetivo explorar preliminarmente si el ACA podía penetrar en los embriones vivos y perjudicar su potencial de desarrollo a través del cocultivo in vitro con embriones de ratón. Métodos. Se recogieron embriones de ratón y se utilizaron para el cultivo in vitro con un anticuerpo policlonal contra la proteína A de los cromosomas (CENP-A); a continuación, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia para determinar la penetración del anticuerpo en los embriones, y se observó el potencial de desarrollo del embrión. Resultados. Todos los embriones cultivados con el anticuerpo anti-CENP-A mostraron inmunofluorescencia en el núcleo, mientras que ninguno de los embriones de los grupos de control mostró inmunofluorescencia. Además, los embriones cultivados con el anticuerpo anti-CENP-A experimentaron un deterioro significativo del crecimiento en comparación con los controles. Conclusión. Los embriones de ratón pueden ser una diana directa para el ACA in vitro antes de la implantación. Sin embargo, el mecanismo preciso necesita más aclaración.
1. Introducción
Un estudio reciente reveló trastornos en la maduración de los ovocitos y en el desarrollo embrionario temprano en mujeres con anticuerpos anticentrómero (ACA) positivos en su sangre periférica . Más recientemente, encontramos que las mujeres positivas a ACA tenían un porcentaje significativamente menor de ovocitos maduros y tasa de escisión embrionaria en comparación con las mujeres negativas a ACA , revelando aún más el impacto potencial de ACA en la fertilidad femenina. Se sabe que el ACA es uno de los miembros de los ANA. Se descubrió por primera vez en 1980 como un anticuerpo específico contra el centrómero en el suero de pacientes con calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y síndrome de telangiectasia (CREST) . Ahora, el ACA ha sido reconocido como un eficaz marcador auxiliar de diagnóstico para la esclerosis sistémica (SSc). Como se ha informado, las pacientes con SSc son susceptibles de tener diferentes resultados adversos en el embarazo, incluyendo una mayor tasa de aborto espontáneo, parto prematuro, bebés pequeños e infertilidad . Además, la prevalencia de la infertilidad en pacientes con SSc es alta, y la tasa de éxito del tratamiento de la infertilidad es relativamente baja, lo que requiere una mayor investigación.
Ya en la década de 1990, los investigadores intentaron microinyectar ACA en óvulos de ratón, lo que provocó trastornos del movimiento y la segregación cromosómica . Se sabe que el cinetocoro es el lugar de unión de los microtúbulos del huso en la región centromérica de un cromosoma . Además, es la estructura dinámica para la mitosis, la meiosis y otras actividades importantes de las células. Por lo tanto, sería razonable inferir que ACA podría interferir con la meiosis o la mitosis en las células vivas.
El centrómero es un complejo de ADN-proteína, y su ensamblaje está coregulado por las cromatinas centroméricas y su complejo proteico asociado . La proteína A del centrómero (CENP-A) es una de las proteínas constitutivas del centrómero con funciones biológicas relativamente claras que ha sido mayormente estudiada; su importante papel en el ensamblaje e implementación funcional del centrómero ha sido repetidamente verificado . Además, al igual que CENP-B, CENP-A se considera un antígeno diana importante de ACA.
Se especuló que ACA podría ser uno de los ANAs más estrechamente asociados con la maduración anormal de los ovocitos y la escisión del embrión. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue explorar el impacto potencial de ACA en los embriones de etapa temprana a través del cocultivo in vitro con embriones de ratón.
2. Materiales y métodos
2.1. Embriones de ratón
Se indujo la superovulación en ratones ICR de raza externa mediante la estimulación con gonadotrofina de suero de yegua preñada (10 UI por vía intraperitoneal (i.p.)) y gonadotrofina coriónica humana (10 UI i.p. después de 48 h) y se apareó con machos ICR. Las hembras fueron sacrificadas 24 horas después del apareamiento. Los embriones en fase inicial se recogieron mediante una disección brusca de las trompas de Falopio y se utilizaron en los experimentos. El Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen aprobó este estudio.
2.2. Cultivo de embriones in vitro
Los embriones se cultivaron en el medio serial de Quinn (Sage, USA). Para el grupo de anticuerpos, se añadió al medio un anticuerpo policlonal de conejo contra el CENP-A de ratón (libre de albúmina de suero bovino y azida, productos personalizados de Abcam, Reino Unido). La concentración del anticuerpo en el medio fue de 35 μg/mL (modificada según la bibliografía). Para el grupo de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (que sirvió de control), se añadió al medio la solución PBS (pastilla PBS, Millipore, Merck, Alemania) con el mismo volumen que la solución de anticuerpos. El grupo de control en blanco comprendía el medio sin ningún aditivo.
2.3. Ensayo de inmunofluorescencia
En el segundo y tercer día de cultivo, se recogieron de tres a cinco embriones de cada plato de los tres grupos para el ensayo de inmunofluorescencia, con el fin de detectar si las señales del anticuerpo anti-CENP-A estaban presentes en los embriones después del cocultivo. Los procedimientos para el ensayo de inmunofluorescencia fueron los siguientes: Los embriones se fijaron en polioximetileno al 4% y luego se impregnaron con Triton X-100 al 0,5% (Sigma, EE.UU.), seguido de un sellado en suero de burro normal al 5% (Jackson Immunoresearch, EE.UU.). A continuación, los embriones se incubaron durante 1 hora con IgG anti-conejo de burro marcada con 488 (Invitrogen, Reino Unido, dilución 1:1000), se enjuagaron, se incubaron con 1 μg /mL de DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro, Cell Signaling Technology, EE.UU.) durante 15 minutos, se volvieron a enjuagar y se fijaron en una placa para su posterior observación al microscopio. Para descartar los falsos positivos del grupo experimental, los embriones del grupo de anticuerpos se incubaron con PBS en lugar de con IgG anti-conejo de burro marcado con 488 (grupo de anticuerpos para el control).
2.4. Desarrollo de embriones cocultivados (ensayo de embriotoxicidad)
La recogida y el cultivo de los embriones para este ensayo de embriotoxicidad fueron los mismos que los descritos anteriormente, excepto que los embriones permanecieron en los platos durante todo el periodo de 3 días. Los embriones de cada grupo se examinaron para determinar su estado de desarrollo al tercer y quinto día (el primer día se refería al día de la recogida de ovocitos). Se registraron los siguientes estadios de desarrollo: estadios de 6 a 8 células en el tercer día, y estadios de blastocisto, mórula, 2 a 8 células y atrésico en el quinto día.
2.5. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 13 (SPSS, IL, USA). Se utilizó una prueba de chi-cuadrado y pruebas de partición de chi-cuadrado para comparar los datos cualitativos. Un valor inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo mediante la prueba de chi-cuadrado entre los tres grupos, y un valor inferior a 0,0167 se utilizó para indicar la significación estadística en la partición de las pruebas de chi-cuadrado entre los grupos.
3. Resultados
3.1. Inmunofluorescencia
Todos los embriones cultivados con el anticuerpo anti-CENP-A mostraron una fuerte inmunofluorescencia en sus núcleos, mientras que ninguno de los embriones de los grupos PBS y control en blanco, así como el grupo de anticuerpos para el control, mostraron inmunofluorescencia (Figura 1).
3.2. Ensayo de embriotoxicidad
En comparación con los grupos PBS y control en blanco, los porcentajes de embriones en fase de 6 a 8 células en el tercer día, así como de embriones en fase de blástula y mórula en el quinto día, fueron significativamente menores en el grupo de anticuerpos. Los potenciales de desarrollo de los embriones fueron comparables entre los grupos PBS y de control en blanco (Tabla 1).
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| El primer día se refería al día de recogida de embriones. se consideró estadísticamente significativo entre los tres grupos. a frente a los grupos de anticuerpos y PBS. b frente a los grupos de anticuerpos y control en blanco. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discusión
En 1999, los investigadores descubrieron que todos los embriones de ratón cultivados con IgG antinuclear purificada mostraban una fuerte inmunofluorescencia en las células embrionarias y experimentaban un deterioro significativo del crecimiento o la muerte en comparación con los cultivados con inmunoglobulinas de control . Esto indicaba que los ANA podían unirse directamente a los embriones in vitro. Sin embargo, no se conocían los epítopos precisos porque no se encontraron antígenos nucleares ni fosfolípidos en la zona. En los embriones de ratón en fase de 2 células, se sintetiza transitoriamente un conjunto de nucleoproteínas y cambia la composición de la cromatina embrionaria, lo que sugiere que los embriones tempranos pueden poseer epítopos para los ANA . Además, la unión es relativamente específica, ya que el anticuerpo antitiroideo y los anticuerpos de individuos sanos no muestran evidencia de unión a los embriones. La microinyección de suero que contiene ACA en ovocitos de ratón podría dificultar la congresión cromosómica y provocar la detención meiótica en interfase o la detención mitótica en prometafase .
En el presente estudio, todos los embriones cultivados con anticuerpos policlonales anti-CENP-A mostraron una fuerte inmunofluorescencia de anticuerpos contra componentes nucleares (que se especuló que eran anticuerpos anti-CENP-A) y experimentaron un aparente deterioro del crecimiento embrionario, lo que indica que los embriones de ratón pueden ser una diana directa para algunos ACAs in vitro antes de la implantación. Además, en la mayoría de los embriones cocultivados, siempre sólo uno o algunos de los blastómeros mostraron fluorescencia. Tal vez, la densidad de las estructuras en y alrededor del centrómero impide la accesibilidad del anticuerpo anti-CENP-A, o el blastómero con fluorescencia detectable estaba inclinado a la apoptosis y mostraba estructuras relativamente sueltas que permitían la accesibilidad del anticuerpo anti-CENP-A. Sin embargo, el mecanismo preciso necesita una mayor aclaración.
Aunque no existe un concepto definido para la entrada de anticuerpos en las células vivas, y el mecanismo implicado se desconoce todavía, estos estudios proporcionaron pruebas de la entrada de anticuerpos en las células vivas. Por ejemplo, la IgG anti-ribonucleoproteína podía entrar selectivamente en los linfocitos T, mientras que había relativamente menos receptores Fc en la superficie de los linfocitos T. Esto sugirió que podrían estar implicados algunos otros mecanismos relevantes para la regulación no Fc, que podrían estar asociados con estructuras similares a antígenos en la superficie de los linfocitos, lo que implica que los anticuerpos de ribonucleoproteína interactuaron con los antígenos de ribonucleoproteína en la superficie celular para regular su acceso a las células vivas .
Este estudio también descubrió que el potencial de desarrollo embrionario estaba significativamente deteriorado tras el cultivo con anticuerpos anti-CENP-A, mostrando porcentajes significativamente menores de embriones en fase de 6 a 8 células al tercer día y de embriones en fase de blástula al quinto día. De hecho, en un estudio anterior se descubrió que los embriones de ratón cultivados con IgG purificada de suero ANA-positivo mostraban un potencial de desarrollo embrionario significativamente deteriorado. Los ANA podían penetrar en las estructuras subcelulares que contenían los antígenos correspondientes, donde podían identificar y unirse a epítopos en las regiones funcionales importantes. Estos autoanticuerpos podían inhibir significativamente la función de los antígenos tanto in vivo como in vitro.
En conclusión, los embriones cultivados con anticuerpos anti-CENP-A experimentaron un deterioro significativo del crecimiento o la muerte. Por lo tanto, los embriones podrían ser una diana directa del anticuerpo anti-CENP-A.
Aprobación ética
El Comité de Ética Médica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen aprobó el estudio (nº 75).
Conflictos de intereses
Ying Ying, Xi Guo, Yiping Zhong y Canquan Zhou declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nº 81701518), la Oficina de Ciencia y Tecnología e Información de Guangzhou (nº. 2014J4100161), Science & Technology Project of Guangdong Province (no. 2013B021800271), y Population and Family Planning Commission of Guangdong Province (no. 20132048). Este estudio fue apoyado por el Laboratorio Clave de Medicina Reproductiva de la Provincia de Guangdong del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen. El estudio también contó con el apoyo de dos laboratorios clave del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou; fueron el Laboratorio Clave para las Principales Enfermedades Obstétricas de la Provincia de Guangdong y el Laboratorio Clave de Reproducción y Genética de los Institutos de Educación Superior de Guangdong.