El Western Blot (WB) es un método común para detectar y analizar proteínas. Se basa en una técnica que consiste en transferir, también conocida como blotting, las proteínas separadas por electroforesis del gel a una membrana donde pueden visualizarse de forma específica. El procedimiento fue descrito por primera vez por H. Towbin et al en 1979 (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979) y dos años después recibió su nombre por W. Neal Burnette (Burnette, 1981). Towbin et al describieron la transferencia electroforética de proteínas desde geles de poliacrilamida a láminas de nitrocelulosa en las que se obtenía con precisión el patrón original del gel. El montaje consiste en un conjunto estándar de siete pasos, Figura 1.
Figura 1. Los pasos estándar del Western Blotting.
Las muestras se preparan y se cargan en un gel y durante la electroforesis las proteínas cargadas negativamente se mueven hacia el ánodo cargado positivamente. Para seguir analizando las proteínas, se transfieren a una membrana en un procedimiento llamado blotting. Tras la transferencia, la membrana se bloquea para evitar la interacción no deseada entre la membrana y la proteína en los siguientes pasos. Para visualizar la proteína de interés, se suele sondear primero la membrana con un anticuerpo primario específico de la proteína, seguido de un anticuerpo secundario marcado que se utiliza para la detección. Se toma una imagen de la membrana y se analiza el resultado.
Al añadir una solución marcadora separada a uno de los pocillos del gel, es posible estimar el tamaño de la proteína además de las interacciones de los anticuerpos que se utilizan para verificar la proteína específica. La separación en el gel no sólo se debe al tamaño, sino que también depende en cierta medida de la carga molecular, las regiones hidrofóbicas y el grado de desnaturalización. La configuración del experimento puede variar de muchas maneras para adaptarse a la investigación específica. Al analizar los resultados, deben tenerse en cuenta las variaciones entre carriles en cuanto a las tasas de carga y transferencia entre blots. Además, la relación no lineal de la señal generada a través del rango de concentración de las muestras es también un aspecto a tener en cuenta a la hora de interpretar los resultados. El resultado de un experimento de WB depende de tres factores importantes: la capacidad del anticuerpo para unirse a una proteína específica, la fuerza de la interacción y la concentración de la propia proteína de interés. Además, la especificidad de la unión a la diana y una baja reactividad cruzada son también características importantes. El resultado de la WB no siempre es fácil de interpretar, ya que el tamaño de la proteína puede variar con respecto al peso teórico debido a las modificaciones postraduccionales, como la glicosilación, o a las interacciones con otras proteínas. Sin embargo, el WB es un método muy común y casi todos los anticuerpos comerciales disponibles han sido validados utilizando este método.
Tecnología
Preparación de la muestra
El primer paso de un WB es preparar la muestra, por ejemplo, tejido, células u otra solución, que va a ser analizada. Por lo general, el tejido debe ser dividido por mezcla, homogeneización o sonicación. Se añaden tampones para lisar las células y solubilizar las proteínas y, a menudo, se añade un inhibidor para evitar la desnaturalización o la degradación. Se aplican diferentes tipos de métodos de filtración y centrifugación para seguir preparando las muestras. Es importante determinar la concentración total de proteínas del extracto generado para poder cargar una cantidad específica en el gel que permita la comparación entre muestras. Normalmente se utiliza un ensayo bioquímico para determinar la concentración de proteínas. El extracto se diluye con un tampón de carga compuesto por glicerol y un colorante (por ejemplo, azul de bromofenol). El glicerol se utiliza para simplificar la carga aumentando la densidad del extracto y el colorante se añade para visualizar la muestra. Se aplica calor sobre las muestras para romper las estructuras de la proteína, lo que ayudará a mantener la carga negativa de la neutralización (Mahmood & Yang, 2012). Preferiblemente se incluyen controles positivos y negativos en el montaje para confirmar la identidad de la proteína así como la actividad del anticuerpo.
Electroforesis en gel
Después de la preparación de la muestra, el extracto está listo para ser cargado para separar las proteínas según su tamaño mediante electroforesis en gel. Se aplica un campo eléctrico sobre el gel que hace que las moléculas cargadas se muevan. En WB se utilizan geles de poliacrilamida para la separación de proteínas, por lo que el método se denomina electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) cuando se utiliza la condición nativa. Para las condiciones de desnaturalización, se añade dodecil sulfato de sodio (SDS) al sistema, por lo que el método se denomina SDS-PAGE. El SDS se une a la proteína y forma una micela con carga negativa alrededor de la proteína, independientemente de su carga inherente. La condición de desnaturalización disuelve la estructura tridimensional de las proteínas y la carga de la proteína pasa a ser relativa a su tamaño, lo que da lugar a la separación de las proteínas sólo por su tamaño. Cuando se utilizan condiciones nativas, la movilidad depende tanto de la carga como del tamaño hidrodinámico, lo que permite la detección de cambios de carga debidos a la degradación química, a cambios conformacionales debidos al plegado o al desdoblamiento, a la agregación o a otros eventos de unión.
El gel suele constar de dos secciones con diferentes densidades: (i) un gel de apilamiento, y (ii) un gel de separación, Figura 2. Las diferencias entre las dos secciones están en el pH y la concentración del gel. Con un pH algo ácido y una menor concentración de acrilamida, el gel de apilamiento separa mal las proteínas, pero les permite formar bandas nítidas muy definidas antes de entrar en el gel de separación. Con condiciones más básicas y una mayor concentración de gel, el gel de separación hace que las proteínas se diferencien por tamaño, ya que las proteínas más pequeñas se desplazan más rápidamente en el gel que las más grandes. Los geles prefabricados son convenientes; sin embargo, es posible moldearlos a mano. El gel se sumerge en tampón y las muestras de proteínas y los marcadores se cargan en los pocillos del gel. Se aplica un voltaje en el gel y las proteínas comenzarán a desplazarse por el gel debido a su carga eléctrica negativa. La selección del voltaje adecuado es importante ya que un voltaje demasiado alto sobrecalentará el gel y quizás deforme las bandas.
Figura 2. Un gel típico sumergido en tampón.
Transferencia a la membrana
Después de la electroforesis en gel, las proteínas se transfieren a una membrana de soporte sólido, que es el tercer paso del Western Blot. En el proceso de transferencia se aplica voltaje para transferir las proteínas del gel a la membrana. El montaje incluye esponjas, papeles de filtro, el gel y la membrana, que se coloca entre el gel y el electrodo positivo, Figura 3. Esto asegura la migración de las proteínas con carga negativa del gel a la membrana. Hay tres tipos de membranas: nitrocelulosa, difluoruro de polivinilideno (PVDF) y nylon. Aunque las membranas de nylon son superiores en varios aspectos, la alta fijación de fondo y la tinción irreversible de algunos colorantes hacen que este tipo de membrana sea menos común que las otras dos alternativas. La principal ventaja de las membranas de nitrocelulosa es el bajo fondo, independientemente del método de detección. Debido a un tamaño de poro medio relativamente grande, las membranas de nitrocelulosa no deben utilizarse para la transferencia de proteínas de bajo peso molecular. Además, cuando se seca, la membrana se vuelve frágil, lo que dificulta su manipulación. La membrana de PVDF, más estable, permite el reetiquetado y es más cómoda de almacenar. La naturaleza hidrofóbica del PVDF resulta en una alta capacidad de unión de proteínas, sin embargo, como consecuencia el fondo es también mayor.
Figura 3. Las proteínas en el gel se secan en una membrana y la muestra se visualiza mediante el bloqueo, la adición de anticuerpos y el lavado de acuerdo con un programa determinado.
Hay dos métodos para el blotting llamados húmedo y semiseco. Las condiciones húmedas se prefieren cuando la transferencia debe ser eficiente y dar alta calidad en cuanto a bandas distintas y nítidas. Además, es la mejor opción para la transferencia de complejos proteicos más grandes. El gel, la membrana y los papeles de filtro están completamente sumergidos en el tampón durante la transferencia y no hay riesgo de que el gel se seque. El blotting semiseco es más rápido y se necesita menos volumen de tampón. Sin embargo, este método de transferencia suele ser menos eficiente, especialmente para las proteínas más grandes, y existe el riesgo de sobrecalentamiento y secado del gel cuando se utilizan tiempos de transferencia prolongados.
Sondeo de anticuerpos
El cuarto paso del WB es el sondeo de anticuerpos. Para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos a la membrana, en lugar de la unión específica a la proteína de interés, se utiliza una sustancia para bloquear los sitios residuales en la membrana. Las sustancias más habituales son la leche descremada en polvo, la albúmina de suero bovino (BSA) al 5% diluida en solución salina tamponada con Tris Tween (TBST), el suero normal de cabra, la caseína o la gelatina de pescado (Mahmood & Yang, 2012). La leche es fácil de conseguir y barata, pero no es adecuada para todas las etiquetas de detección. La gelatina de pescado proporciona un fondo más bajo pero puede enmascarar algunas proteínas, además de ser un tampón de bloqueo relativamente caro. La BSA es barata, mientras que el suero puede contener inmunoglobulinas que dan lugar a una reactividad cruzada. La selección cuidadosa del agente de bloqueo es clave, ya que ninguno de los tampones de bloqueo es ideal para todas las diferentes interacciones antígeno-anticuerpo. El procedimiento de bloqueo consiste en incubar la membrana en el tampón de bloqueo adecuado durante una hora o más. Cuando se utilizan tiempos de incubación largos, el bloqueo debe realizarse a +4°C para descartar el riesgo de artefactos de tinción o de fondo. El bloqueo es un delicado equilibrio entre la reducción del fondo sin disminuir la señal de la proteína de interés.
La membrana bloqueada se incuba a continuación con el anticuerpo primario. El anticuerpo se diluye a una concentración adecuada en TBST, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o tampón de lavado. Es preferible incubar el anticuerpo con BSA si se va a reutilizar el anticuerpo. Después de lavar la membrana, ésta se incuba con el anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se marca con un reportero. Cuando se utiliza un anticuerpo policlonal como anticuerpo secundario, puede dar lugar a un cierto fondo. En el caso de la tinción de fondo, el anticuerpo secundario puede bloquearse previamente con suero no inmune del huésped en el que se generó. Se recomienda optimizar la concentración del anticuerpo secundario debido a las variaciones bastante extendidas entre los anticuerpos así como el sistema de detección utilizado.
Detección
En el quinto paso de un WB, el complejo proteína-anticuerpo-anticuerpo se detecta en la membrana. Hay varios tipos de etiquetado del anticuerpo secundario, por ejemplo, enzimas, fluoróforos, biotinilación, conjugación con oro y radioisótopos, como se ejemplifica en la Figura 4. Entre las enzimas, la más común es la HRP utilizada junto con sustancias quimioluminiscentes, quimifluorescentes o cromogénicas. La HRP tiene una alta especificidad de sustrato que proporciona un bajo fondo, es estable y barata. En la quimioluminiscencia, la enzima HRP cataliza la oxidación del luminol a partir del reactivo de detección de peróxido de luminol. La reacción de varios pasos genera la emisión de luz. Algunas sustancias químicas, como los fenoles, pueden potenciar la luz emitida. Un método directo es el uso de la fluorescencia; los fluoróforos emiten luz después de ser excitados y no se necesita ningún agente de detección. Es muy adecuado para el Western cuantitativo y, dado que diferentes fluoróforos emiten luz de diferentes longitudes de onda, es posible realizar la multiplexación y la detección específica de más de una proteína a la vez. El uso de una sustancia química y/o una enzima para inducir la generación de un fluoróforo activo a partir de un sustrato fluorogénico se denomina quimifluorescencia. Para mejorar aún más la intensidad de la señal se puede utilizar un sistema basado en la biotina y la estreptavidina en dos pasos. La conjugación con oro es también un método en el que las proteínas se tiñen de rojo oscuro debido a la acumulación de oro. También es posible utilizar radioisótopos pero requieren una manipulación especial y son bastante caros.
Figura 4. Diferentes sistemas de reportero.
Imagen
La imagen es el sexto paso del WB y la captación puede ser analógica utilizando una película, o digitalmente preformada con una cámara CCD o un escáner que capte los diferentes tipos de señales emitidas. El dispositivo de captación de imágenes CCD permite la cuantificación con una alta sensibilidad de detección y un amplio rango lineal sin residuos químicos ni necesidad de un cuarto oscuro. Puede utilizarse para detectar membranas, geles teñidos o para aplicaciones con luz ultravioleta.
Análisis
El último paso de un WB es analizar los resultados. En una aplicación cualitativa típica, se confirma la presencia de una proteína de interés, se aproxima la cantidad por inspección visual y se determina el tamaño por comparación con un marcador. Las mejoras y los desarrollos, especialmente hacia los reactivos de detección de alta sensibilidad y las técnicas de imagen avanzadas, convierten a la WB en una herramienta potencial para el análisis cuantitativo. Las aplicaciones cuantitativas implican una definición de la cantidad de proteína en términos relativos o absolutos. Hay que tener en cuenta algunos factores como la sensibilidad, la estabilidad de la señal, el rango dinámico lineal, la normalización y la relación señal/ruido. El mínimo de proteína que puede verse en un ensayo dado da los límites de detección (LOD), y el límite de la intensidad de la señal que puede utilizarse de forma fiable para una cuantificación precisa es el límite de cuantificación (LOQ). Los factores que afectan a estos términos son la calidad y las concentraciones de los anticuerpos, así como los tiempos de exposición cuando se considera la cantidad mínima de proteína detectada. Un sistema de señal estable amplía la ventana de tiempo para alcanzar una alta sensibilidad, múltiples exposiciones y la posibilidad de detectar bandas débiles. El rango que permite una cuantificación uniforme y precisa en la que la intensidad de la señal sigue siendo proporcional a la cantidad de proteína se denomina rango dinámico lineal. Es importante evitar la saturación de la señal debido a cantidades excesivas de proteína o altas concentraciones de anticuerpos. Un LOD bajo y la cuantificación de señales débiles y fuertes dan un rango dinámico lineal amplio. La proteína de interés debe normalizarse con respecto a una referencia interna que permita fluctuaciones en la cantidad de proteína cargada en cada pocillo o diferentes concentraciones. Esto puede conseguirse con una proteína de mantenimiento o con una proteína añadida. La relación entre la señal y el ruido es importante para cuantificar adecuadamente la proteína. Esto es de suma importancia cuando se detectan bandas débiles en las que se espera un fondo más alto.
Ejemplos específicos
Aunque el peso teórico de muchas proteínas difiere del peso real debido a las modificaciones postraduccionales, casi todos los anticuerpos comerciales se validan utilizando WB.
Dentro del proyecto Human Protein Atlas se utiliza WB para el control de calidad de los anticuerpos policlonales generados en el proyecto. Después de la purificación, los anticuerpos se utilizan para detectar bandas en una configuración de lisados y diferentes tejidos. Actualmente se implementa el uso de siRNA WB para analizar más a fondo los anticuerpos.
Todo el protocolo de WB, incluyendo la dilución de los anticuerpos primarios y secundarios y el paso final de detección, se realiza de forma rutinaria y no se realiza ninguna optimización experimental específica para los anticuerpos individuales. En un primer momento, se lisan proteínas totales de líneas celulares y tejidos seleccionados (15?g de RT-4, U-251MG, hígado y amígdala, así como 25?g de plasma empobrecido en HSA e IgG) y un marcador (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; Thermo Scientific) se cargan en geles de gradiente Criterion SDS-PAGE al 4-20% (Bio-Rad Laboratories) y se ejecutan en condiciones reductoras, seguidas de la transferencia a membranas de PVDF (Bio-Rad Laboratories) utilizando Trans-Blot turbo (Bio-Rad Laboratories) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los geles de gradiente SDS-PAGE de Criterion, junto con el marcador, permiten analizar proteínas de tamaños comprendidos entre 10 y 250 kDa. A continuación, las membranas se activan en metanol antes de bloquearlas (5% de leche en polvo, 0,5% de Tween 20, 1× TBS; 1 mM de tris-HCl, 0,15 M de NaCl) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación constante. A continuación, se incuban las membranas con el anticuerpo primario HPA diluido a ~0,6?g/ml, durante 1 h, seguido de un lavado (1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween) y de la incubación durante 45 minutos con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (anti-conejo porcino 1:4000, Dako). Para los anticuerpos comerciales se utiliza una dilución de 1:500 y el anticuerpo secundario es anti-conejo porcino (1:3000, Dako) o anti-ratón de cabra (1:3000, Dako). Se utiliza una cámara CCD (Bio-Rad Laboratories) para la detección de la señal del sustrato (Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate; Millipore).
Un Western Blot típico de HPA se ve en la Figura 5.
Figura 5. Resultado típico de Western Blot utilizando HRP y una cámara CCD.
Referencias y enlaces
El artículo que nombra el método y lo describe con más detalle:
Burnette WN&periodo;, «Western blotting»: transferencia electroforética de proteínas desde geles de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida a nitrocelulosa no modificada y detección radiográfica con anticuerpos y proteína A&periodo; Anal Biochem&periodo; (1981)
PubMed: 6266278
El artículo describe la técnica de Western Blotting, la teoría y la resolución de problemas:
Mahmood T et al., Western blot: técnica, teoría, y resolución de problemas&periodo; N Am J Med Sci&periodo; (2012)
PubMed: 23050259 DOI: 10.4103/1947-2714.100998
El primer artículo que describe la transferencia electroforética de proteínas a la membrana:
Towbin H et al, Transferencia electroforética de proteínas desde geles de poliacrilamida a láminas de nitrocelulosa: procedimiento y algunas aplicaciones&periodo; 1979&periodo; Biotecnología&periodo; (1992)
PubMed: 1422008
Principios y métodos de Western Blotting – un manual gratuito proporcionado por GE Healthcare:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-se/service-and-support/handbooks
Western Blotting en el proyecto Human Atlas Protein:
Western Blotting
Wikipedia – enlaces relevantes:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Enciclopedia del Western blot – Mucha información útil sobre el Western blot, así como la resolución de problemas, protocolos y selecciones de anticuerpos:
http://www.western-blot.us
Antibodypedia – Una base de datos de acceso abierto de anticuerpos disponibles públicamente y su utilidad en varias aplicaciones:
http://www.antibodypedia.com
VIDEO: Western blotting paso a paso, un tutorial realizado por Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu