Complete aggregatieroute van amyloïd β (1-40) en (1-42) opgelost op een atomair schoon grensvlak

RESULTATEN

Figuur 1A toont structuren die eerder zijn afgeleid van nucleaire magnetische resonantie (NMR) van Aβ-40 monomeer en Aβ-42 monomeer in oplossing. De twee isovormen verschillen door de lengte van de peptidesequentie, waarbij Aβ-42 twee extra aminozuurresiduen (Iso41 en Ala42) heeft in vergelijking met Aβ-40, wat resulteert in de waargenomen snellere aggregatie van Aβ-42 (38). De Aβ-40 en Aβ-42 oplossingen werden bereid in PBS bufferoplossing (pH 7,4), en voor elke AFM beeldvorming experiment, 10 ul van de amyloïde oplossing werd drop-cast op atomair schoon grafeen (zie Materials and Methods voor details over de bereiding en afzetting van Aβ-40 en Aβ-42 en het reinigen van protocollen voor grafeen). Vijf minuten na afzetting van de amyloïdoplossing, werd het grafeenoppervlak gespoeld met 5 ml zuiver water om overtollige bufferoplossing te verwijderen en te voorkomen dat ongebonden peptiden in oplossing van adsorberen op een van beide het oppervlak of de AFM tip (zie Materialen en Methoden voor details van AFM beeldvorming in de gesloten vloeistof cel). Figuur 1B toont een AFM beeld opgenomen na het deponeren van de Aβ-40 peptide oplossing (geïncubeerd gedurende 0,5 uur) op epitaxiaal grafeen en afgebeeld in zuiver water. De AFM hoogte beeld toont de aanwezigheid van enkele deeltjes met gemengde grootteverdeling. Om de diameter van de individuele deeltjes te bepalen, extraheren we de dwarsdoorsnede profiel over de deeltjes, zoals getoond in Fig. 1C. Van het hoogteprofiel, observeren we nanoscopische variaties in hoogte in de richting loodrecht op het grafeenoppervlak voor verschillende deeltjes (dwarsdoorsnede profiel gemarkeerd door witte lijnen in Fig. 1B). De waargenomen breedte van de deeltjes van de ruwe AFM gegevens is een convolutie tussen de AFM tip en bolvormige deeltjesradius en is groter dan de ware breedte van het deeltje. Echter, de gemeten hoogte niet afhankelijk van de geometrie van de AFM tip, en aangezien de hoogte gelijk is aan de diameter van sferische deeltjes, is het dan mogelijk om de diameter van de deeltjes zoals amyloïde oligomeren (27) en van high-aspect ratio cilindrische objecten zoals amyloïde fibrillen (39) te schatten. Op basis van soortgelijke hoogteprofiel metingen geëxtraheerd langs honderden enkele deeltjes eerder toegeschreven als amyloïde oligomeren (27, 36, 40), het kleinste deeltje (uitgaande van een sferische vorm) hebben we kunnen detecteren in de huidige studie voor de Aβ-40 isovorm heeft een diameter van ~ 1,65 nm, vergelijkbaar met eerdere AFM rapporten van Aβ-40 peptiden (28). Om het aantal Aβ monomeren in de deeltjes gemeten in onze studie te schatten, vertrouwen we op de methode voorgesteld door Erickson (41) om gemeten aggregaat volume om te zetten in moleculair gewicht door te veronderstellen dat een bolvorm voor de single Aβ deeltjes. Op basis van deze aanname, schatten we dat de kleinste Aβ-40 deeltje van een gemiddelde diameter van 1,9 ± 0,25 nm overeenkomt met een molecuulgewicht van ~ 3,0 kDa, die ruwweg overeenkomt met een monomeer. We passen dezelfde conversie protocol voor het schatten van het molecuulgewicht van Aβ-42 deeltjes gemeten door AFM.

Volgende vergeleken we de grootteverdeling en morfologie van Aβ-42 aggregaten met identieke concentratie (5 μM), buffercondities (PBS) (pH 7.4), incubatietijd (0,5 uur), en depositie omstandigheden (10-μl volume van Aβ-42 oplossing, 5-min depositie tijd, gevolgd door het spoelen van het oppervlak met 5 ml zuiver water) zoals gebruikt voor de beeldvorming Aβ-40. Figuur 1D is een AFM topografische beeld van deeltjes van Aβ-42 geclassificeerd als oligomeren uit eerdere studies (24, 25). De Aβ-42 deeltjes zijn aanwezig in verschillende diameters zoals weergegeven in de dwarsdoorsnede profiel in Fig. 1E (geëxtraheerd langs de lijn aangegeven in Fig. 1D) en zijn zichtbaar groter en dichter bevolkt voor Aβ-42 dan voor de Aβ-40 oligomeren (Fig. 1B) geïncubeerd voor dezelfde tijdsperiode (0,5 uur). De kleinste oligomeer die we hebben kunnen meten met een AFM voor de Aβ-42 isovorm had een gemiddelde diameter van 3,7 ± 0,2 nm, wat overeenkomt met een molecuulgewicht van ~ 25,0 kDa dat ruwweg overeenkomt met een hexamer. Op basis van hoogteprofiel analyse uitgevoerd op ~ 200 individuele Aβ-40 en Aβ-42 oligomeren, halen we een gemiddelde diameter van (4,1 ± 1,1) nm voor Aβ-40 (Fig. 1F, bovenste rode balk histogram) en (8,4 ± 2,1) nm voor Aβ-42 (Fig. 1F, onderste groene balk histogram). De kwalitatieve (AFM topografie beelden) en kwantitatieve (diameterverdeling uit hoogteprofiel) gegevens van onze analyse zijn consistent met eerdere waarnemingen dat Aβ-42 heeft de neiging om sneller aggregeren dan Aβ-40 peptiden (3, 24, 27, 36, 38, 42).

Om de metingen in water in plaats van in PBS buffer te rechtvaardigen, vergeleken we de grootteverdeling van Aβ-40 en Aβ-42 oligomeren in zowel PBS en zuiver water. Het vergelijken van de statistische verdelingen van deeltjesdiameter (afgeleid uit hoogte trace analyse) voor enkele Aβ-40 en Aβ-42 oligomeren (dezelfde incubatietijd van 1 uur) in zowel PBS buffer en zuiver water, hogere diameter waarden worden gevonden voor deeltjes gemeten in PBS buffer dan in zuiver water (zie fig. S3, A en B, voor gedetailleerde statistische plots). Hier schrijven we de gemeten toename van de gemiddelde deeltjesdiameter voor Aβ-40 en Aβ-42 oligomeren geadsorbeerd op grafeen in PBS bufferoplossing de verontreiniging van de AFM probe in bufferzoutoplossing, wat kan leiden tot overschatting van de werkelijke morfologie van de oligomeren wat resulteert in opgeblazen deeltjesgrootte waarden. We bevestigden deze hypothese door het aantonen van de verontreiniging van de AFM tip tijdens de beeldvorming van de amyloïde aggregaten in PBS buffer (zie fig. S2 voor AFM beelden van tip strepen en dubbele tip effecten in PBS buffer medium). Om nauwkeurig te meten van de diameter van oligomere aggregaten met single-deeltje resolutie, bleven we AFM metingen uit te voeren in zuiver water en op atomair schoon grafeen. Figuur 2 is een plot van de evolutie van de diameter van oligomeren in de tijd. Elk punt in de plot is gebaseerd op dwarsdoorsnede profielen geëxtraheerd uit de honderden individuele oligomeren op tal van incubatietijd intervallen van 0,5 tot 110 uur voor Aβ-40 (rode curve) en Aβ-42 (groene curve) geadsorbeerd aan het grafeen-water interface. Een algemene toename in oligomeerdiameter is zichtbaar in de plot (Fig. 2) voor beide peptide isovormen met een algehele grotere oligomeerdiameter voor Aβ-42 in vergelijking met Aβ-40. We hebben niet waargenomen de wijdverspreide aanwezigheid van oligomere aggregaten voor de Aβ-40 soorten na ~ 80 uur incubatietijd, terwijl in het geval van Aβ-42, oligomere aggregaten waren nog steeds overvloedig aanwezig, zelfs na ~ 110 uur incubatietijd op basis van de AFM data-analyse (Fig. 4G). Dit resultaat suggereert dat laag-moleculaire gewicht oligomeren van Aβ-42 langer blijven bestaan tijdens aggregatie dan oligomeren van Aβ-40. Berekende MD structuren later gepresenteerd (Fig. 6) kwantificeren verder de interacties tussen de Aβ-42 oligomeren en de onderliggende grafeen oppervlak. Bij het monitoren van de veranderingen in oligomeer morfologie in de tijd, ontdekten we ook de vorming van fibrillaire aggregaten voor zowel Aβ-40 en Aβ-42 soorten. Figuur 3A is een AFM topografische registreren van de eerste tekenen van het verschijnen van de fibrillaire aggregaten langs de Aβ-40 aggregatie pad na de amyloïde oplossing werd geïncubeerd gedurende 30 uur (aangegeven door de zwarte pijl in de plot in Fig. 2). Deze fibrillaire aggregaten waren van verschillende hoogte, zoals blijkt uit de dwarsdoorsnede profielen in Fig. 3B geëxtraheerd langs de zwarte lijnen aangegeven in de AFM hoogte beeld (Fig. 3A). Deze fibrillaire aggregaten werden waargenomen samen met de oligomere aggregaten (zie sectie S2 voor AFM beelden verkregen over andere gebieden van hetzelfde monster) waaruit de aanwezigheid van een mengsel van fibrillen en oligomere aggregaten. Van AFM hoogteprofielen gemeten over verschillende individuele filamenten zoals getoond in Fig. 3A, nemen we de diameter (afgeleid uit de hoogte) van deze objecten te variëren van ~ 3 tot 8 nm, consistent met diameter waarden gemeten met AFM voor Aβ-40 fibrillaire aggregaten geadsorbeerd op schoon silicium (28). In het verleden zijn deze fibrillaire aggregaten met nodulaire morfologie die zich tijdens de vroege stadia van amyloïde assemblage zijn geclassificeerd als protofibrillen, die tussenproducten in de amyloïde fibrillatie route en voorlopers van volwassen fibrillen (22, 27, 36, 40).

Aβ-40 protofibrilvorming (met karakteristieke nodulaire structuur) werd voor het eerst waargenomen na 30 uur incubatietijd, terwijl de vorming van protofibrillen voor Aβ-42 al na 8 uur werd vastgesteld. Figuur 3C is een AFM beeld dat de aanwezigheid van oligomeren toont samen met een kleine populatie van fibrillaire Aβ-42 aggregaten met variërende hoogten, zoals weergegeven in Fig. 3D. Dit verschil in snelheid van aggregatie en resulterende protofibril structuren bevestigt dat Aβ-42 isovormen sneller aggregeren in oplossing dan Aβ-40. Samen met de oligomere aggregaten en enkele protofibrils, zagen we platte sheet-type structuren bestaande uit lokaal uitgelijnde protofibrils na ~ 30 uur incubatie van Aβ-42 (zie Fig. 3E en sectie S3 voor verdere AFM karakterisering van de protofibrils). Eerder werd het optreden van soortgelijke lateraal interageren sheet-type Aβ-42 structuren gemeld op grafiet opgelost met behulp van AFM (30). Om de hoogte verschillen voor de eerste waargenomen Aβ-40 en Aβ-42 protofibrils, die op verschillende incubatietijd intervallen verschijnen kwantificeren, voerden we statistische analyse (Fig. 3F) van de hoogten van ~ 350 individuele protofibrils voor elke soort. Op basis van de hoogteverdeling, berekenen we gemiddelde protofibril hoogtes van (3,9 ± 1,6) nm en (5,5 ± 1,5) nm voor Aβ-40 (Fig. 3F, bovenste rode histogram) en Aβ-42 (Fig. 3F, onderste groene histogram), respectievelijk. De volgende verandering in morfologie we waargenomen tijdens amyloïde aggregatie is de vorming van rijpe fibrillen met hun langgerekte structuur. De atomaire structuur van rijpe Aβ-40 (10, 43) en Aβ-42 (44, 45) fibrillen is bekend van cryo-elektronenmicroscopie (43, 44) en solid-state NMR (45). Echter, de verschillen in de fysische kenmerken zoals fibril hoogte en lengte van de rijpe Aβ-40 en Aβ-42 fibrillen die zich voordoen bij verschillende incubatie tijdsintervallen, die kunnen worden beïnvloed door omgevingsfactoren (46), moeten nog volledig worden gecatalogiseerd onder omgevingsomstandigheden.

Onder de omstandigheden gebruikt in deze studie, rijpe fibrillen geaggregeerd in oplossing verscheen voor het eerst voor Aβ-40 na 110 uur en op ongeveer 90 uur incubatietijd voor Aβ-42. Figuur 4A is een groot gebied AFM hoogtebeeld van de rijpe Aβ-40 fibrillen die verschijnen als gebogen (aangegeven met rode pijlen) en langwerpige individuele fibrillen (aangegeven met blauwe pijlen). Naast de enkele fibrillen met een gemiddelde diameter van (8,5 ± 0,5) nm (fibril diameter afgeleid van hoogte spoor uitgaande van cilindrische morfologie voor fibrillen, zie sectie S4 voor volwassen Aβ-40 fibril hoogte statistieken), observeren we ook, van de topografische en de gelijktijdig verworven fase-contrast AFM beeld (Fig. 4B), de aanwezigheid van knooppunten (aangegeven met gele pijlen in Fig. 4A) van waaruit individuele fibrillen vertakken. We detecteerden geen overheersende aanwezigheid van oligomere aggregaten samen met de rijpe fibrillen van Aβ-40 zoals blijkt uit de hoogte, fase, en overlay beeld (Fig. 4C). Vervolgens lossen we het optreden van rijpe Aβ-42 fibrillen voor het eerst waargenomen na 90 uur incubatie zoals weergegeven in de hoge-resolutie AFM hoogte (Fig. 4D) en fase-contrast beeld (Fig. 4E). De rijpe fibril topologie waargenomen voor Aβ-42 verschilt opmerkelijk van de eerder waargenomen topologie van rijpe Aβ-40 fibrillen (Fig. 3A). Aβ-42 rijpe fibrillen zijn dicht opeengepakt, gericht uitgelijnd, en verschijnen als stijve cilindrische structuren, zeer verschillend van de gebogen en geïsoleerde Aβ-40 rijpe fibrillen. Deze observatie wordt ook bevestigd door de dwarsdoorsnede profielanalyse (Fig. 4F). Meer bepaald onthult de groene lijn in Fig. 4D het dicht opeengepakte laterale profiel van de rijpe Aβ-42 fibrillen. Op basis van sectionele analyse langs ~ 200 individuele rijpe fibrillen, berekenen we de gemiddelde rijpe Aβ-42 fibril diameter tot (9,6 ± 0,7) nm (zie fig. S6A voor rijpe Aβ-42 fibril hoogte statistieken).

Nauwkeuriger inspectie van de hoogte gegevens en de fase-contrast AFM beeld onthult het bestaan van sferische oligomere aggregaten samen met de rijpe fibrillen in dit stadium van Aβ-42 aggregatie. De overheersende populatie van oligomere aggregaten is te onderscheiden in de fase-contrast beeld (Fig. 4G). Naast het verstrekken van kwalitatieve bewijs voor het bestaan van oligomere aggregaten in de richting van de verzadigingsfase van amyloïde assemblage, kwantificeren we ook de grootteverdeling van deze oligomere aggregaten op basis van het hoogteprofiel analyse uitgevoerd op ~ 100 individuele oligomere aggregaten. We gekarakteriseerd deeltjes aanwezig na het begin van volwassen fibrillen (90 uur) tot het punt waar de oligomeren waren niet meer direct gedetecteerd door de AFM (110 uur). Figuur 5A toont de verdeling van oligomere aggregaten diameter die zich op 90, 95, 100, 105 en 110 uur van incubatie. Deze gegevens identificeren een smalle diameterverdeling van aggregaten in het groottebereik van ~ 7 tot 9 nm (wat overeenkomt met een molecuulgewicht van 221 ± 80 kDa dat ruwweg overeenkomt met een bolvormig 50-mer) die de neiging hebben om samen te bestaan met rijpe fibrillen voor Aβ-42. Dicht opeengepakte fibrillen verschenen tijdens de laatste fasen van Aβ-40 en Aβ-42 fibrillogenese. Figuur 5B is een groot gebied AFM hoogtebeeld onthullen de nanoschaal topologie van de assemblage van rijpe Aβ-40 fibrillen op het grafeen-water-interface wanneer de amyloïde oplossing werd geïncubeerd gedurende 150 uur. De rijpe Aβ-40 fibrillaire aggregaten vormen met geen directionele uitlijning zoals kan worden gezien uit zowel de hoogte en de bijbehorende fase-contrast beeld (Fig. 5C). Op basis van de AFM gegevens verkregen vanaf het begin van de rijpe fibrillen (Fig. 4A) tot de uiteindelijke geaggregeerde toestand (Fig. 5B; merk op dat de dicht opeengepakte fibril topologie niet drastische verandering ondergaan na 150 uur incubatie), observeren we de vorming van clusters samengesteld uit gebundelde fibrillen. Deze clusters zijn op hun beurt verbonden door een kleine populatie van dun verdeelde langwerpige fibrillen met een gemiddelde hoogte van (8,8 ± 1,2) nm. De volgende duidelijke morfologische verandering langs de Aβ-42 aggregatie route werd waargenomen na ~ 130 uur incubatie, dat is eerder dan het verschijnen van de rijpe Aβ-40 fibrillen op 110 uur. Figuur 5D is een groot-gebied hoogte beeld van de rijpe Aβ-42 fibrillen na een incubatietijd van 150 uur. Het fase-contrast beeld (Fig. 5E) onthult intrigerende details van de dichte fibril morfologie. De Aβ-42 fibrillen werden uitgelijnd waargenomen wanneer de amyloïde oplossing gedurende 110 uur geïncubeerd werd (Fig. 4G). Deze uitgelijnde fibrillaire structuren hielden aan gedurende langere incubatietijd tot ~ 250 uur zonder drastische veranderingen in de fibril morfologie, wat suggereert dat de laatste fasen van de aggregatie route voor de Aβ-42 fibrillen al bereikt is na ongeveer 130 uur. Figuur 5 (F en G) is de hoogte en fase-contrast beeld verkregen op een dergelijke uitgelijnde Aβ-42 fibrillaire regio na 150 uur incubatie.

Fibrillen van Aβ-42 blijven opmerkelijk verschillend van de fibrillaire aggregaat topologie van Aβ-40 soorten geïncubeerd gedurende dezelfde tijdsperiode (Fig. 5B). De hoge-resolutie beelden bevestigen verder de uitlijning van de fibrillen met een gemiddelde hoogte van (9,5 ± 1,1) nm die iets groter is dan de gemiddelde hoogte gemeten voor de rijpe Aβ-40 fibrillen. Om te testen of deze uitlijning effect optreedt als gevolg van sterkere interfibrillaire interacties of grafeen-gemedieerde assemblage, deponeerden we 10 ul van Aβ-42 peptide op een schone glazen dia (zie Materials and Methods voor de reinigingsprocedure en verificatie) met dezelfde depositie en beeldvorming protocol gebruikt voor Aβ-42 adsorptie studies op grafeen en afgebeeld in water en PBS buffer medium. De AFM beelden opgenomen voor Aβ-42 soorten na 150 uur incubatie op het glas-water en glas-PBS interface toonde zeer vergelijkbaar netwerk morfologie zoals gezien op het grafeen-water interface (zie sectie S5). De rijpe Aβ-42 fibrillen werden ook waargenomen om uitlijning vertonen op het glasplaatje bij beeldvorming in bufferoplossing en na het spoelen en beeldvorming van het oppervlak met water. De waargenomen fibrillaire uitlijning op glas geeft aan dat de hydrofiliciteit en ruwheid van de beeldvorming oppervlak niet de dominante factoren die verantwoordelijk zijn voor de lange-afstands ordening van de Aβ-42 fibrillen. De waarneming van fibrillaire uitlijning voor de rijpe Aβ-42 fibrillen en niet voor identiek bereid Aβ-40 fibrillaire aggregaten kan te wijten zijn aan de extra aminozuur residuen alleen aanwezig voor de Aβ-42 peptiden (8, 27) die interfibril interacties kunnen bevorderen. Onlangs is aangetoond dat Ala42, afwezig in Aβ-40, een zoutbrug vormt met Lys28, (45) waardoor de netto lading aan het oppervlak van Aβ-42 fibrillen wordt gebufferd (48). Opkomende informatie over de atomaire structuur van Aβ-42 fibrillen (48) in combinatie met onze AFM waarnemingen van, gemiddeld, langere Aβ-42 fibrillen en tussen de twee centrale monomeren (C, zwart). (E) Verdeling van de maximale dodecamer hoogten bemonsterd boven het grafeenvel tijdens de simulaties.

Om de voorkeursoriëntatie van de dodecamers op het grafeenoppervlak te identificeren, berekenden we de dodecamer-grafeen bindingsenergieën. Uit fig. S9B, vinden we dat de berekende bindingsenergieën (ΔEbinding) een oriëntatie voorkeur voor zowel Aβ-40 en Aβ-42 overeenkomt met een neiging van de dodecamers langs het grafeen blad met de twee plooien liggen naast elkaar, wat bevorderlijk is voor fibril rek. De decompositie van de ΔEbindingswaarden (fig. S9B) toont aan dat de verschillen hun oorsprong vinden in polaire solvatiebindingsenergieën. ΔEpolar is negatief voor de preferente fibril-zaai-oriëntatie maar positief voor de twee andere vlakken, zowel in Aβ-40 als in Aβ-42, wat erop wijst dat het oligomeer-graphene interfaciale water een cruciale rol speelt in het stabiliseren van deze adsorptiemodus. Aangemoedigd door de bovenstaande bevindingen, breidden we de simulaties met deze voorkeursoriëntatie (gemarkeerd als III) uit tot 0,5 μs. De analyses (tenzij anders vermeld) zijn gebaseerd op de laatste 200 ns van de vrije dynamica (fig. S9 toont de tijdlijn van de fractie van native contacten). Aβ-42 en Aβ-40 adopteren zeer vergelijkbare adsorptiemodi met een bijna identiek aantal contacten met grafeen. De onderste inzet in fig. S9D laat zien dat residu Tyr10 in zowel Aβ-40 als Aβ-42 dodecamers stabiele contacten met grafeen bemonstert zonder deelname van de twee extra C-terminale residuen in Aβ-42, wat bevestigt dat residuen Iso41 en Ala42 hun interfold contacten gedurende de gehele periode behouden.

Figuur 6A toont representatieve stabiele conformaties (zoals afgeleid uit vergelijkingen over een reeks van bindingsoriëntaties; zie fig. S9) van Aβ-40 en Aβ-42 12-mer structuren op het grafeen-water-interface in vooraanzicht en zijaanzicht. We kunnen ruwweg vergelijken berekende conformatie-energieën (fig. 6B) door te normaliseren per monomeer, die voorspellen dat Aβ-42 dodecamers zijn stabieler (met ~ 35 kcal/mol) dan Aβ-40 wanneer uitgelijnd in de oriëntatie van fibril rek. Deze berekende voorkeur is consistent met de snellere aggregatie van Aβ-42 waargenomen in onze AFM studie en in eerdere onderzoeken naar Aβ-42 aggregatie, gekoppeld aan de persistentie van oligomeren voor Aβ-42. De belangrijkste bijdrage aan de totale conformatie-energie is afkomstig van de polaire solvatie vrije energie van de dodecamer (fig. S9E), die slechts iets gunstiger is voor Aβ-42 dan voor Aβ-40. De oplosmiddelbijdrage is gekoppeld aan een aanzienlijk ongunstiger (positieve) Coulomb’s elektrostatische energie (~19 kcal/mol) voor Aβ-40, wat aangeeft dat intramoleculaire lading-lading afstotingen significant bijdragen aan de algehele waargenomen instabiliteit voor Aβ-40. Een potentieel interessante bevinding van onze simulaties is het schijnbare verschil in het voorkomen van “prefibrillar” in-register waterstofbruggen (H-bindingen) tussen de twee uiteinden van de dodecamer voor zowel Aβ-40 en Aβ-42 op het grafeen-water interface (Fig. 6, C en D, en tabel S1, en zie ook sectie S6). Sommige eerdere experimenten hebben gemeld dat Aβ fibril groei is unidirectioneel (58, 59), terwijl anderen hebben benadrukt bidirectionele groei (60, 61). Unidirectionele fibrilgroei is toegeschreven aan verschillen in H-binding tussen de twee fibriluiteinden blootgesteld aan het oplosmiddel (één uiteinde is minder fluctuerend en dus meer gesloten en stabieler dan het andere) voor zowel Aβ-40 als Aβ-42, op basis van eerdere MD-simulatiestudies (62). Het is echter niet bekend welk uiteinde daadwerkelijk de toevoeging van monomeren aan fibrillen bevordert, hoewel simulaties hebben aangetoond dat de gesloten uiteinden zich mogelijk sneller uitbreiden dan de open uiteinden (63). Uit onze analyse van de dimeren aan de twee uiteinden (aangeduid als E1 en E2) blootgesteld aan water en de bulk centrale dimeren (aangeduid als C) van dodecamer, vinden we dat het aantal in-register H-bindingen aan het ene uiteinde (E1) significant minder is dan dat van het andere uiteinde (E2) voor zowel Aβ-40 als Aβ-42, wat duidt op een potentieel om unidirectionele groei te ondergaan. Echter, een verschil van 11% (zie tabel S1 en sectie S6) wordt geregistreerd voor de sterkste (≥80%) H-bindingen tussen E2 en E1 voor Aβ-42, terwijl een significant groter verschil van 19% wordt geregistreerd voor Aβ-40, wat impliceert dat Aβ-40 dodecamers meer open zijn (bijna twee keer meer dan voor Aβ-42) aan het fluctuerende uiteinde. Monomeer additie op het E1 uiteinde kan op een meer geordende manier verlopen voor Aβ-42 dan voor Aβ-40, en vanwege het kleinere verschil (met een factor 2) tussen de twee uiteinden van Aβ-42 vergeleken met die in Aβ-40, zou deze modelvoorspelling getest kunnen worden in toekomstige tijd-resolved AFM experimenten.

Zoals eerder benadrukt, speelt de recent gerapporteerde zoutbrug tussen de amino zijketen van Lys28 en de C terminus van Ala42 in de Aβ-42 fibril structuur een rol in het stabiliseren van de S-vormige fibril vouwing (45). De natieve structuur van Aβ-42 met de LS-vormige vouw die in deze studie is gebruikt, heeft geen volledige Lys28-Ala42 zoutbrug. Om interacties te identificeren die specifiek zijn voor Ala42 in “fibril-achtige” dodecamers van Aβ-42, maar niet Aβ-40, berekenden we intra- en interketen residu contacten (zie sectie S6 en fig. S10). Figuur S10A toont de ketenorganisatie in een typische LS-vormige dodecameravouw van Aβ-42 gemarkeerd A tot en met L. De keten-wise heavy-atom contactfrequenties van residuen binnen een afstand van 0,5 nm laten zien dat Ala42 frequent (>50%) intrachain contacten maakt met Lys28 (gemarkeerd door zwarte cirkels op de rechterhelft van de kaart) en het enige intramonomer contact is dat Ala42 maakt in de Aβ-42 dodecamer. Ala42 ondergaat ook inter-keten contacten met Lys28 langs de fibril as (aangegeven met rode cirkels). Beide intra- en interketencontacten kunnen een rol spelen bij de stabilisatie van Aβ-42 waarbij Ala42 betrokken is, die afwezig is in Aβ-40. Figuur S10C toont een representatieve structuur van het dodecamer waar de zijketen NH3+ in Lys28 en de terminal COO- in Ala42 in elkaars nabijheid blijven. De fysische relevantie van de Lys28-Ala42 contacten voor de LS-vorm werd verder beoordeeld door berekening van de verdeling van de afstanden tussen side-chain amino N van Lys28 en backbone carboxylate C van Ala42 voor elke keten in de dodecamer (fig. S10D). Deze contacten pieken op 0,5 nm voor de meeste van de ketens, wat aangeeft dat sterk contact tussen Lys28 en Ala42 (ontbreekt in Aβ-40) kan Aβ-42 stabieler dan Aβ-40 dodecamers en kan een extra rol spelen bij het waarborgen van een sterke uitlijning van Aβ-42 fibrillen zoals waargenomen uit onze AFM beelden. Ten slotte is de berekende verdeling van de maximale dodecamer hoogten op de top van grafeen uit onze simulaties toont een bereik van ~ 7 tot 11 nm voor Aβ-42 (Fig. 6E, rode curve) met een piek op ~ 8 nm voor de gemodelleerde niet-sferische, gelaagde dodecamer assemblages. De totale hoogte waarden verkregen voor Aβ-42 dodecamer uit simulaties is vergelijkbaar met de experimenteel gemeten gemiddelde deeltjes hoogte waarden van (5,8 ± 1,0) nm (zie fig. S3B, top groene statistische plot), die overeenkomt met een molecuulgewicht van ~ 55 kDa.