Kompletter Aggregationsweg von Amyloid β (1-40) und (1-42) aufgelöst an einer atomar sauberen Grenzfläche

ERGEBNISSE

Abbildung 1A zeigt Strukturen, die zuvor aus der kernmagnetischen Resonanz (NMR) von Aβ-40 Monomer und Aβ-42 Monomer in Lösung abgeleitet wurden. Die beiden Isoformen unterscheiden sich durch die Länge der Peptidsequenz, wobei Aβ-42 im Vergleich zu Aβ-40 zwei zusätzliche Aminosäurereste (Iso41 und Ala42) aufweist, was zu der beobachteten schnelleren Aggregation von Aβ-42 führt (38). Die Aβ-40- und Aβ-42-Lösungen wurden in PBS-Pufferlösung (pH 7,4) hergestellt, und für jedes AFM-Imaging-Experiment wurden 10 μl der Amyloidlösung auf atomar sauberes Graphen getropft (siehe Materialien und Methoden für Details zur Herstellung und Ablagerung von Aβ-40 und Aβ-42 sowie Reinigungsprotokolle für Graphen). Fünf Minuten nach der Ablagerung der Amyloidlösung wurde die Graphenoberfläche mit 5 ml reinem Wasser gespült, um überschüssige Pufferlösung zu entfernen und zu verhindern, dass ungebundene Peptide in der Lösung entweder an der Oberfläche oder an der AFM-Spitze adsorbieren (siehe Materialien und Methoden für Details zur AFM-Bildgebung in der geschlossenen Flüssigkeitszelle). Abbildung 1B zeigt ein AFM-Bild, das nach der Ablagerung der Aβ-40-Peptidlösung (Inkubation für 0,5 Stunden) auf epitaktischem Graphen aufgenommen und in reinem Wasser abgebildet wurde. Das AFM-Höhenbild zeigt das Vorhandensein von Einzelpartikeln mit gemischter Größenverteilung. Um den Durchmesser der einzelnen Partikel zu bestimmen, extrahieren wir das Querschnittsprofil über die Partikel, wie in Abb. 1C gezeigt. Aus dem Höhenprofil beobachten wir nanoskopische Höhenvariationen in der Richtung normal zur Graphenoberfläche für verschiedene Partikel (Querschnittsprofil markiert durch weiße Linien in Abb. 1B). Die beobachtete Breite der Partikel aus den AFM-Rohdaten ist eine Faltung zwischen der AFM-Spitze und dem sphärischen Partikelradius und ist größer als die wahre Breite des Partikels. Die gemessene Höhe hängt jedoch nicht von der Geometrie der AFM-Spitze ab, und da die Höhe dem Durchmesser kugelförmiger Partikel entspricht, ist es dann möglich, den Durchmesser von Partikeln wie Amyloid-Oligomeren (27) und von zylindrischen Objekten mit hohem Aspektverhältnis wie Amyloidfibrillen (39) zu schätzen. Auf der Grundlage ähnlicher Höhenprofilmessungen, die entlang von Hunderten von Einzelpartikeln extrahiert wurden, die zuvor als Amyloid-Oligomere (27, 36, 40) attribuiert wurden, hat das kleinste Partikel (unter der Annahme einer sphärischen Form), das wir in der aktuellen Studie für die Aβ-40-Isoform detektieren konnten, einen Durchmesser von ~1,65 nm, vergleichbar mit früheren AFM-Berichten von Aβ-40-Peptiden (28). Um die Anzahl der Aβ-Monomere in den in unserer Studie gemessenen Partikeln abzuschätzen, stützen wir uns auf die von Erickson (41) vorgeschlagene Methode zur Umrechnung des gemessenen Aggregatvolumens in das Molekulargewicht, indem wir eine sphärische Form für die einzelnen Aβ-Partikel annehmen. Auf der Grundlage dieser Annahme schätzen wir, dass das kleinste Aβ-40-Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 1,9 ± 0,25 nm einem Molekulargewicht von ~3,0 kDa entspricht, was in etwa einem Monomer entspricht. Wir wenden das gleiche Umrechnungsprotokoll für die Abschätzung des Molekulargewichts von Aβ-42-Partikeln an, die mittels AFM gemessen wurden.

Nächstens verglichen wir die Größenverteilung und Morphologie von Aβ-42-Aggregaten mit identischer Konzentration (5 μM), Pufferbedingungen (PBS) (pH 7.4), Inkubationszeit (0,5 Stunden) und Ablagerungsbedingungen (10-μl-Volumen der Aβ-42-Lösung, 5-minütige Ablagerungszeit, gefolgt von einer Spülung der Oberfläche mit 5 ml reinem Wasser) wie bei der Abbildung von Aβ-40 verwendet. Abbildung 1D ist eine topographische AFM-Aufnahme von Aβ-42-Partikeln, die als Oligomere aus früheren Studien klassifiziert wurden (24, 25). Die Aβ-42-Partikel liegen in unterschiedlichen Durchmessern vor, wie das Querschnittsprofil in Abb. 1E zeigt (extrahiert entlang der in Abb. 1D angedeuteten Linie), und sind bei Aβ-42 sichtbar größer und dichter besiedelt als bei den Aβ-40-Oligomeren (Abb. 1B), die für die gleiche Zeitspanne (0,5 Stunden) inkubiert wurden. Das kleinste Oligomer, das wir mit dem AFM für die Aβ-42-Isoform messen konnten, hatte einen mittleren Durchmesser von 3,7 ± 0,2 nm, was einem Molekulargewicht von ~25,0 kDa entspricht, das in etwa einem Hexamer entspricht. Aus der Höhenprofilanalyse von ~200 einzelnen Aβ-40 und Aβ-42 Oligomeren ergibt sich ein mittlerer Durchmesser von (4,1 ± 1,1) nm für Aβ-40 (Abb. 1F, oberes rotes Balkenhistogramm) und (8,4 ± 2,1) nm für Aβ-42 (Abb. 1F, unteres grünes Balkenhistogramm). Die qualitativen (AFM-Topographie-Bilder) und quantitativen (Durchmesserverteilung aus Höhenprofil) Daten unserer Analyse stimmen mit früheren Beobachtungen überein, dass Aβ-42 dazu neigt, schneller zu aggregieren als Aβ-40-Peptide (3, 24, 27, 36, 38, 42).

Um die Messungen in Wasser statt in PBS-Puffer zu rechtfertigen, verglichen wir die Größenverteilung von Aβ-40- und Aβ-42-Oligomeren sowohl in PBS als auch in reinem Wasser. Vergleicht man die statistischen Verteilungen des Partikeldurchmessers (abgeleitet aus der Höhenspuranalyse) für einzelne Aβ-40- und Aβ-42-Oligomere (gleiche Inkubationszeit von 1 Stunde) sowohl in PBS-Puffer als auch in reinem Wasser, so findet man höhere Durchmesserwerte für Partikel, die in PBS-Puffer gemessen wurden als in reinem Wasser (siehe Abb. S3, A und B, für detaillierte statistische Plots). Hier führen wir den gemessenen Anstieg des mittleren Partikeldurchmessers für die an Graphen adsorbierten Aβ-40- und Aβ-42-Oligomere in PBS-Pufferlösung auf die Kontamination der AFM-Sonde in Puffersalzlösung zurück, die zu einer Überschätzung der tatsächlichen Morphologie der Oligomere führen könnte, was zu überhöhten Partikelgrößenwerten führt. Wir bestätigten diese Hypothese, indem wir die Kontamination der AFM-Spitze während der Abbildung der Amyloid-Aggregate in PBS-Puffer aufdeckten (siehe Abb. S2 für AFM-Bilder des Spitzenstreifens und der Doppelspitzeneffekte im PBS-Puffermedium). Um den Durchmesser der oligomeren Aggregate mit Einzelpartikelauflösung genau zu messen, führten wir weiterhin AFM-Messungen in reinem Wasser und auf atomar sauberem Graphen durch. Abbildung 2 ist ein Plot der Entwicklung des Durchmessers der Oligomere über die Zeit. Jeder Punkt im Plot basiert auf Querschnittsprofilen, die aus Hunderten von einzelnen Oligomeren bei zahlreichen Inkubationszeitintervallen von 0,5 bis 110 Stunden für Aβ-40 (rote Kurve) und Aβ-42 (grüne Kurve), adsorbiert an der Graphen-Wasser-Grenzfläche, extrahiert wurden. Aus dem Plot (Abb. 2) ist eine allgemeine Zunahme des Oligomerdurchmessers für beide Peptid-Isoformen erkennbar, wobei der Oligomerdurchmesser für Aβ-42 im Vergleich zu Aβ-40 insgesamt größer ist. Für die Aβ-40-Spezies konnten wir nach ~80 Stunden Inkubationszeit keine weit verbreitete Anwesenheit von oligomeren Aggregaten beobachten, wohingegen im Fall von Aβ-42, basierend auf der AFM-Datenanalyse, selbst nach ~110 Stunden Inkubationszeit noch reichlich oligomere Aggregate vorhanden waren (Abb. 4G). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass niedermolekulare Oligomere von Aβ-42 während der Aggregation länger persistieren als Oligomere von Aβ-40. Die später vorgestellten berechneten MD-Strukturen (Abb. 6) quantifizieren weiter die Wechselwirkungen zwischen den Aβ-42-Oligomeren und der darunter liegenden Graphenoberfläche. Bei der Beobachtung der Veränderungen der Oligomermorphologie im Laufe der Zeit konnten wir auch die Bildung von fibrillären Aggregaten für beide Aβ-40- und Aβ-42-Spezies nachweisen. Abbildung 3A ist eine AFM-Topographie, die die ersten Anzeichen des Auftretens der fibrillären Aggregate entlang des Aβ-40-Aggregationsweges registriert, nachdem die Amyloidlösung für 30 Stunden inkubiert wurde (angezeigt durch den schwarzen Pfeil im Plot in Abb. 2). Diese fibrillären Aggregate waren von unterschiedlicher Höhe, wie aus den Querschnittsprofilen in Abb. 3B hervorgeht, die entlang der schwarzen Linien im AFM-Höhenbild (Abb. 3A) extrahiert wurden. Diese fibrillären Aggregate wurden zusammen mit den oligomeren Aggregaten beobachtet (siehe Abschnitt S2 für AFM-Bilder, die über andere Bereiche der gleichen Probe aufgenommen wurden), was das Vorhandensein einer Mischung aus Fibrillen und oligomeren Aggregaten zeigt. Aus AFM-Höhenprofilen, die über mehrere einzelne Filamente gemessen wurden, wie in Abb. 3A gezeigt, beobachten wir, dass der Durchmesser (abgeleitet aus der Höhe) dieser Objekte zwischen ~3 und 8 nm variiert, was mit Durchmesserwerten übereinstimmt, die mit AFM für fibrilläre Aβ-40-Aggregate gemessen wurden, die auf sauberem Silizium adsorbiert sind (28). In der Vergangenheit wurden diese fibrillären Aggregate mit knotiger Morphologie, die in den frühen Stadien der Amyloid-Assemblierung auftreten, als Protofibrillen klassifiziert, die Zwischenstufen im Amyloid-Fibrillationsweg und Vorläufer reifer Fibrillen sind (22, 27, 36, 40).

Die Bildung von Aβ-40-Protofibrillen (mit charakteristischer knotiger Struktur) wurde erstmals nach 30 Stunden Inkubationszeit beobachtet, während die Bildung von Protofibrillen für Aβ-42 bereits nach 8 Stunden nachgewiesen wurde. Abbildung 3C ist eine AFM-Aufnahme, die das Vorhandensein von Oligomeren zusammen mit einer kleineren Population von fibrillären Aβ-42-Aggregaten mit unterschiedlichen Höhen zeigt, wie in Abb. 3D dargestellt. Dieser Unterschied in der Aggregationsgeschwindigkeit und den resultierenden Protofibrillenstrukturen bestätigt, dass Aβ-42-Isoformen in Lösung schneller aggregieren als Aβ-40. Zusammen mit den oligomeren Aggregaten und einzelnen Protofibrillen beobachteten wir nach ~30 Stunden Inkubation von Aβ-42 flache, blattartige Strukturen, die aus lokal ausgerichteten Protofibrillen bestanden (siehe Abb. 3E und Abschnitt S3 für weitere AFM-Charakterisierung der Protofibrillen). Zuvor wurde über das Auftreten ähnlicher, lateral interagierender, blattartiger Aβ-42-Strukturen auf Graphit berichtet, die mittels AFM aufgelöst wurden (30). Um die Höhenunterschiede für die ersten beobachteten Aβ-40- und Aβ-42-Protofibrillen, die zu unterschiedlichen Inkubationszeitpunkten auftreten, zu quantifizieren, führten wir eine statistische Analyse (Abb. 3F) der Höhen von ~350 einzelnen Protofibrillen für jede Spezies durch. Anhand der Höhenverteilung errechnen wir mittlere Protofibrillenhöhen von (3,9 ± 1,6) nm und (5,5 ± 1,5) nm für Aβ-40 (Abb. 3F, oberes rotes Histogramm) bzw. Aβ-42 (Abb. 3F, unteres grünes Histogramm). Die nächste Veränderung in der Morphologie, die wir während der Amyloid-Aggregation beobachteten, ist die Bildung von reifen Fibrillen mit ihrer länglichen Struktur. Die atomare Struktur von reifen Aβ-40 (10, 43) und Aβ-42 (44, 45) Fibrillen ist aus der Kryo-Elektronenmikroskopie (43, 44) und Festkörper-NMR (45) bekannt. Die Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften wie Fibrillenhöhe und -länge der reifen Aβ-40- und Aβ-42-Fibrillen, die bei verschiedenen Inkubationszeitintervallen auftreten und durch Umweltfaktoren beeinflusst werden können (46), sind jedoch unter Umgebungsbedingungen noch nicht vollständig katalogisiert.

Unter den in dieser Studie verwendeten Bedingungen traten reife, in Lösung aggregierte Fibrillen für Aβ-40 erst nach 110 Stunden und für Aβ-42 nach etwa 90 Stunden Inkubationszeit auf. Abbildung 4A ist ein großflächiges AFM-Höhenbild der reifen Aβ-40-Fibrillen, die als gebogene (mit roten Pfeilen gekennzeichnet) und längliche Einzelfibrillen (mit blauen Pfeilen gekennzeichnet) erscheinen. Zusätzlich zu den Einzelfibrillen mit einem mittleren Durchmesser von (8,5 ± 0,5) nm (Fibrillendurchmesser abgeleitet aus der Höhenspur unter der Annahme einer zylindrischen Morphologie für Fibrillen; siehe Abschnitt S4 für die Höhenstatistik der reifen Aβ-40-Fibrillen), beobachten wir aus dem topographischen und dem gleichzeitig aufgenommenen Phasenkontrast-AFM-Bild (Abb. 4B) auch das Vorhandensein von Verzweigungen (angedeutet mit gelben Pfeilen in Abb. 4A), von denen einzelne Fibrillen abzweigen. Wir konnten keine überwiegende Anwesenheit von oligomeren Aggregaten zusammen mit den reifen Aβ-40-Fibrillen feststellen, wie das Höhen-, Phasen- und Überlagerungsbild zeigt (Abb. 4C). Als nächstes lösen wir das Auftreten von reifen Aβ-42-Fibrillen auf, die erstmals nach 90 Stunden Inkubation beobachtet wurden, wie im hochauflösenden AFM-Höhen- (Abb. 4D) und Phasenkontrastbild (Abb. 4E) gezeigt wird. Die für Aβ-42 beobachtete Topologie der reifen Fibrillen unterscheidet sich deutlich von der zuvor beobachteten Topologie der reifen Aβ-40-Fibrillen (Abb. 3A). Reife Aβ-42-Fibrillen sind dicht gepackt, richtungsorientiert und erscheinen als starre zylindrische Strukturen, ganz anders als die gekrümmten und isolierten reifen Aβ-40-Fibrillen. Diese Beobachtung wird auch durch die Analyse des Querschnittsprofils bestätigt (Abb. 4F). Insbesondere die grüne Linie in Abb. 4D zeigt das dicht gepackte seitliche Profil der reifen Aβ-42-Fibrillen. Auf der Basis der Querschnittsanalyse entlang ~200 einzelner reifer Fibrillen berechnen wir den mittleren reifen Aβ-42-Fibrillendurchmesser auf (9,6 ± 0,7) nm (siehe Abb. S6A für die Statistik der reifen Aβ-42-Fibrillenhöhe).

Eine genauere Betrachtung der Höhendaten und des Phasenkontrast-AFM-Bildes zeigt die Existenz sphärischer oligomerer Aggregate zusammen mit den reifen Fibrillen in diesem Stadium der Aβ-42-Aggregation. Die vorherrschende Population oligomerer Aggregate ist im Phasenkontrastbild unterscheidbar (Abb. 4G). Zusätzlich zum qualitativen Nachweis der Existenz oligomerer Aggregate in der Sättigungsphase der Amyloid-Aggregation quantifizieren wir auch die Größenverteilung dieser oligomeren Aggregate auf der Grundlage der Höhenprofilanalyse, die an ~100 einzelnen oligomeren Aggregaten durchgeführt wurde. Wir charakterisierten Partikel, die nach dem Beginn der reifen Fibrillen (90 Stunden) vorhanden waren, bis zu dem Punkt, an dem die Oligomere nicht mehr direkt durch das AFM detektiert wurden (110 Stunden). Abbildung 5A zeigt die Verteilung des Durchmessers der oligomeren Aggregate, die nach 90, 95, 100, 105 und 110 Stunden der Inkubation auftreten. Diese Daten identifizieren eine enge Durchmesserverteilung von Aggregaten im Größenbereich von ~7 bis 9 nm (entsprechend einem Molekulargewicht von 221 ± 80 kDa, was in etwa einem sphärischen 50-mer entspricht), die tendenziell mit reifen Fibrillen für Aβ-42 koexistieren. Dicht gepackte Fibrillen erschienen während der letzten Stadien der Aβ-40 und Aβ-42 Fibrillogenese. Abbildung 5B ist ein großflächiges AFM-Höhenbild, das die nanoskalige Topologie der Ansammlung von reifen Aβ-40-Fibrillen an der Graphen-Wasser-Grenzfläche zeigt, wenn die Amyloidlösung 150 Stunden lang inkubiert wurde. Die reifen Aβ-40-Fibrillenaggregate bilden sich ohne gerichtete Ausrichtung, wie sowohl aus dem Höhen- als auch aus dem entsprechenden Phasenkontrastbild ersichtlich ist (Abb. 5C). Anhand der AFM-Daten, die vom Beginn der reifen Fibrillen (Abb. 4A) bis zum endgültigen Aggregatzustand (Abb. 5B; beachten Sie, dass sich die dicht gepackte Fibrillentopologie nach 150 Stunden Inkubation nicht mehr drastisch verändert), beobachten wir die Bildung von Clustern, die aus gebündelten Fibrillen bestehen. Diese Cluster sind wiederum durch eine kleine Population von spärlich verteilten, länglichen Fibrillen mit einer mittleren Höhe von (8,8 ± 1,2) nm verbunden. Die nächste deutliche morphologische Veränderung entlang des Aβ-42-Aggregationsweges wurde nach ~130 Stunden Inkubation beobachtet, was früher ist als das Auftreten der reifen Aβ-40-Fibrillen nach 110 Stunden. Abbildung 5D ist ein großflächiges Höhenbild der reifen Aβ-42-Fibrillen nach einer Inkubationszeit von 150 Stunden. Das Phasenkontrastbild (Abb. 5E) zeigt verblüffende Details der dichten Fibrillenmorphologie. Die Aβ-42-Fibrillen waren ausgerichtet, als die Amyloidlösung für 110 Stunden inkubiert wurde (Abb. 4G). Diese ausgerichteten fibrillären Strukturen blieben bei längerer Inkubationszeit bis zu ~250 Stunden bestehen, ohne dass sich die Fibrillenmorphologie drastisch veränderte, was darauf hindeutet, dass das Endstadium des Aggregationsweges für die Aβ-42-Fibrillen bereits nach etwa 130 Stunden erreicht ist. Abbildung 5 (F und G) ist das Höhen- und Phasenkontrastbild, das von einer solchen ausgerichteten Aβ-42-Fibrillenregion nach 150 Stunden Inkubation aufgenommen wurde.

Die Fibrillen von Aβ-42 unterscheiden sich deutlich von der Topologie der fibrillären Aggregate von Aβ-40 Spezies, die für die gleiche Zeitdauer inkubiert wurden (Abb. 5B). Die hochauflösenden Bilder bestätigen weiterhin die Ausrichtung der Fibrillen mit einer mittleren Höhe von (9,5 ± 1,1) nm, die etwas größer ist als die mittlere Höhe, die für die reifen Aβ-40-Fibrillen gemessen wurde. Um zu testen, ob dieser Ausrichtungseffekt aufgrund stärkerer interfibrillärer Wechselwirkungen oder einer Graphen-vermittelten Assemblierung auftritt, haben wir 10 μl Aβ-42-Peptid auf einen sauberen Glasobjektträger aufgebracht (siehe Materialien und Methoden für das Reinigungsverfahren und die Verifizierung), wobei wir dasselbe Aufbringungs- und Bildgebungsprotokoll wie bei den Aβ-42-Adsorptionsstudien auf Graphen verwendet und in Wasser und PBS-Puffermedium abgebildet haben. Die AFM-Bilder, die für Aβ-42-Spezies nach 150 Stunden Inkubation an der Glas-Wasser- und Glas-PBS-Grenzfläche aufgenommen wurden, zeigten eine sehr ähnliche Netzwerkmorphologie wie an der Graphen-Wasser-Grenzfläche (siehe Abschnitt S5). Die reifen Aβ-42-Fibrillen zeigten auch eine Ausrichtung auf dem Glasobjektträger, wenn sie in Pufferlösung und nach dem Abspülen und Abbilden der Oberfläche mit Wasser abgebildet wurden. Die beobachtete fibrilläre Ausrichtung auf Glas deutet darauf hin, dass die Hydrophilie und die Rauheit der abbildenden Oberfläche nicht die dominierenden Faktoren sind, die für die langreichweitige Anordnung der Aβ-42-Fibrillen verantwortlich sind. Die Beobachtung der fibrillären Ausrichtung für die reifen Aβ-42-Fibrillen und nicht für identisch präparierte Aβ-40-Fibrillenaggregate könnte auf die zusätzlichen Aminosäurereste zurückzuführen sein, die nur für die Aβ-42-Peptide vorhanden sind (8, 27) und die Interfibrilleninteraktionen fördern könnten. Kürzlich wurde gezeigt, dass Ala42, das in Aβ-40 fehlt, eine Salzbrücke mit Lys28 bildet (45) und dadurch die Nettoladung, die auf der Oberfläche von Aβ-42-Fibrillen vorhanden ist, puffert (48). Neue Informationen über die atomare Struktur von Aβ-42-Fibrillen (48) in Verbindung mit unseren AFM-Beobachtungen von im Durchschnitt längeren Aβ-42-Fibrillen und zwischen den beiden zentralen Monomeren (C, schwarz). (E) Verteilung der maximalen Dodekamer-Höhen, die während der Simulationen über dem Graphenblatt abgetastet wurden.

Um die bevorzugte Orientierung der Dodekamer auf der Graphenoberfläche zu identifizieren, haben wir die Dodekamer-Graphen-Bindungsenergien berechnet. Aus fig. S9B entnehmen wir, dass die berechneten Bindungsenergien (ΔEbinding) eine Orientierungspräferenz sowohl für Aβ-40 als auch für Aβ-42 zeigen, was einer Vorliebe der Dodecamere entlang der Graphenfolie entspricht, wobei die beiden Falten nebeneinander liegen, was der Fibrillenverlängerung förderlich ist. Die Zerlegung der ΔE-Bindungswerte (Abb. S9B) zeigt, dass die Unterschiede von polaren Solvationsbindungsenergien herrühren. ΔEpolar ist negativ für die bevorzugte Fibrillen-Saatgut-Orientierung, aber positiv für die beiden anderen Ebenen, sowohl in Aβ-40 als auch in Aβ-42, was darauf hindeutet, dass das Wasser an der Oligomer-Graphen-Grenzfläche eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung dieses Adsorptionsmodus spielt. Ermutigt durch die obigen Ergebnisse haben wir die Simulationen mit dieser bevorzugten Orientierung (gekennzeichnet als III) auf 0,5 μs erweitert. Die Analysen (sofern nicht anders angegeben) basieren auf den letzten 200 ns der freien Dynamik (Abb. S9 zeigt die Zeitachse des Anteils der nativen Kontakte). Aβ-42 und Aβ-40 nehmen sehr ähnliche Adsorptionsmodi mit einer fast identischen Anzahl von Kontakten zu Graphen an. Das untere Inset in Abb. S9D zeigt, dass der Rest Tyr10 sowohl in Aβ-40- als auch in Aβ-42-Dodecamern stabile Kontakte mit Graphen probt, ohne Beteiligung der beiden zusätzlichen C-terminalen Reste in Aβ-42, was bestätigt, dass die Reste Iso41 und Ala42 ihre Interfold-Kontakte durchgängig beibehalten.

Abbildung 6A zeigt repräsentative stabile Konformationen (wie aus Vergleichen über eine Reihe von Bindungsorientierungen abgeleitet; siehe Abb. S9) von Aβ-40 und Aβ-42 12-mer Strukturen an der Graphen-Wasser-Grenzfläche in Vorder- und Seitenansicht. Wir können die berechneten Konformationsenergien (Abb. 6B) grob vergleichen, indem wir pro Monomer normalisieren. Diese sagen voraus, dass Aβ-42-Dodecamere stabiler sind (um ~35 kcal/mol) als Aβ-40, wenn sie in der Orientierung der Fibrillenverlängerung ausgerichtet sind. Diese berechnete Präferenz ist konsistent mit der schnelleren Aggregation von Aβ-42, die in unserer AFM-Studie und in früheren Untersuchungen der Aβ-42-Aggregation beobachtet wurde, verbunden mit der Persistenz von Oligomeren für Aβ-42. Der Hauptbeitrag zur Gesamtkonformationsenergie kommt von der polaren freien Solvatationsenergie des Dodekamers (Abb. S9E), die für Aβ-42 nur geringfügig günstiger ist als für Aβ-40. Der Beitrag des Lösungsmittels ist gekoppelt mit einer wesentlich ungünstigeren (positiven) Coulomb’schen elektrostatischen Energie (~19 kcal/mol) für Aβ-40, was darauf hindeutet, dass intramolekulare Ladungs-Ladungs-Repulsionen signifikant zu der insgesamt beobachteten Instabilität für Aβ-40 beitragen. Ein potentiell interessantes Ergebnis unserer Simulationen ist der offensichtliche Unterschied im Auftreten von „präfibrillären“ in-register Wasserstoffbrückenbindungen (H-Bindungen) zwischen den beiden Enden des Dodekamers sowohl für Aβ-40 als auch für Aβ-42 an der Graphen-Wasser-Grenzfläche (Abb. 6, C und D, und Tabelle S1, und siehe auch Abschnitt S6). Einige frühere Experimente haben berichtet, dass das Aβ-Fibrillenwachstum unidirektional ist (58, 59), während andere ein bidirektionales Wachstum hervorgehoben haben (60, 61). Unidirektionales Fibrillenwachstum wurde aus früheren MD-Simulationsstudien sowohl für Aβ-40 als auch für Aβ-42 auf Unterschiede in der H-Bindung zwischen den beiden dem Lösungsmittel ausgesetzten Fibrillenenden zurückgeführt (ein Ende ist weniger fluktuierend und daher geschlossener und stabiler als das andere) (62). Es ist jedoch nicht bekannt, welches Ende tatsächlich die Anlagerung von Monomeren an Fibrillen fördert, obwohl Simulationen gezeigt haben, dass sich die geschlossenen Enden schneller ausdehnen können als die offenen Enden (63). Aus unserer Analyse der Dimere an den beiden Enden (bezeichnet als E1 und E2), die dem Wasser ausgesetzt sind, und der zentralen Dimere (bezeichnet als C) des Dodekamers, finden wir, dass die Anzahl der in-register H-Bindungen an einem Ende (E1) signifikant geringer ist als die des anderen Endes (E2), sowohl für Aβ-40 als auch für Aβ-42, was auf ein Potenzial für unidirektionales Wachstum hindeutet. Allerdings wird für die stärksten (≥80%) H-Bindungen zwischen E2 und E1 für Aβ-42 ein Unterschied von 11% (siehe Tabelle S1 und Abschnitt S6) aufgezeichnet, während für Aβ-40 ein deutlich größerer Unterschied von 19% aufgezeichnet wird, was bedeutet, dass Aβ-40-Dodecamere am fluktuierenden Ende offener sind (fast doppelt so viel wie bei Aβ-42). Die Monomeraddition am E1-Ende könnte bei Aβ-42 geordneter ablaufen als bei Aβ-40, und aufgrund des geringeren Unterschieds (um den Faktor 2) zwischen den beiden Enden von Aβ-42 im Vergleich zu denen in Aβ-40 könnte diese Modellierungsvorhersage in zukünftigen zeitaufgelösten AFM-Experimenten getestet werden.

Wie bereits hervorgehoben, spielt die kürzlich berichtete Salzbrücke zwischen der Aminoseitenkette von Lys28 und dem C-Terminus von Ala42 in der Aβ-42-Fibrillenstruktur eine Rolle bei der Stabilisierung der S-förmigen Fibrillenfaltung (45). Die in dieser Studie verwendete native Struktur von Aβ-42 mit der LS-förmigen Faltung weist keine vollständige Lys28-Ala42-Salzbrücke auf. Um Wechselwirkungen zu identifizieren, die spezifisch für Ala42 in „fibrillenartigen“ Dodecameren von Aβ-42, aber nicht Aβ-40 sind, haben wir Intra- und Interketten-Restkontakte berechnet (siehe Abschnitt S6 und Abb. S10). Abbildung S10A zeigt die Kettenorganisation in einer typischen LS-förmigen Dodekamer-Faltung von Aβ-42, markiert mit A bis L. Die kettenweisen Schweratom-Kontakthäufigkeiten von Resten innerhalb eines Abstands von 0,5 nm zeigen, dass Ala42 häufige (>50%) Intraketten-Kontakte mit Lys28 (markiert durch schwarze Kreise in der rechten Hälfte der Karte) macht und der einzige intramonomere Kontakt ist, den Ala42 im Aβ-42-Dodekamer macht. Ala42 unterliegt auch Interchain-Kontakten mit Lys28 entlang der Fibrillenachse (markiert durch rote Kreise). Sowohl diese Intra- als auch Interchain-Kontakte könnten eine Rolle bei der Stabilisierung von Aβ-42 spielen, wobei Ala42 beteiligt ist, das in Aβ-40 fehlt. Abbildung S10C zeigt eine repräsentative Struktur des Dodekamers, in der die Seitenkette NH3+ in Lys28 und das terminale COO- in Ala42 in enger Nachbarschaft zueinander stehen. Die physikalische Relevanz der Lys28-Ala42-Kontakte für die LS-Faltung wurde weiter beurteilt, indem die Verteilung der Abstände zwischen dem Seitenketten-Amino-N von Lys28 und dem Rückgrat-Carboxylat-C von Ala42 für jede Kette im Dodekamer berechnet wurde (Abb. S10D). Diese Kontakte erreichen für die meisten Ketten einen Spitzenwert von 0,5 nm, was darauf hindeutet, dass ein starker Kontakt zwischen Lys28 und Ala42 (der in Aβ-40 fehlt) Aβ-42 stabiler als Aβ-40-Dodecamere macht und eine zusätzliche Rolle bei der Sicherstellung einer starken Ausrichtung der Aβ-42-Fibrillen spielen könnte, wie sie in unseren AFM-Bildern beobachtet wurde. Schließlich zeigt die berechnete Verteilung der maximalen Dodekamer-Höhen auf der Graphen-Oberfläche aus unseren Simulationen einen Bereich von ~7 bis 11 nm für Aβ-42 (Abb. 6E, rote Kurve) mit einem Peak bei ~8 nm für die modellierten nicht-sphärischen, geschichteten Dodekamer-Assemblies. Die aus den Simulationen erhaltenen Gesamthöhenwerte für Aβ-42-Dodekamer sind vergleichbar mit den experimentell gemessenen mittleren Partikelhöhenwerten von (5,8 ± 1,0) nm (siehe Abb. S3B, oberer grüner statistischer Plot), was einem Molekulargewicht von ~55 kDa entspricht.