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Vía de agregación completa del amiloide β (1-40) y (1-42) resuelta en una interfaz atómicamente limpia

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RESULTADOS

La figura 1A muestra estructuras derivadas previamente de la resonancia magnética nuclear (RMN) del monómero Aβ-40 y del monómero Aβ-42 en solución. Las dos isoformas se diferencian por la longitud de la secuencia peptídica, ya que Aβ-42 tiene dos residuos de aminoácidos adicionales (Iso41 y Ala42) en comparación con Aβ-40, lo que da lugar a la agregación más rápida observada de Aβ-42 (38). Las soluciones de Aβ-40 y Aβ-42 se prepararon en una solución tampón PBS (pH 7,4), y para cada experimento de obtención de imágenes por AFM, se depositaron 10 μl de la solución de amiloide en grafeno atómicamente limpio (véase Materiales y Métodos para los detalles sobre la preparación y deposición de Aβ-40 y Aβ-42 y los protocolos de limpieza del grafeno). Cinco minutos después de la deposición de la solución de amiloide, la superficie de grafeno se lavó con 5 ml de agua pura para eliminar el exceso de solución tampón y evitar que cualquier péptido no unido en la solución se adsorba en la superficie o en la punta de AFM (véase Materiales y Métodos para los detalles de las imágenes de AFM en la celda líquida cerrada). La Figura 1B muestra una imagen de AFM grabada después de depositar la solución de péptidos Aβ-40 (incubada durante 0,5 horas) sobre el grafeno epitaxial y con imágenes en agua pura. La imagen de altura de AFM muestra la presencia de partículas individuales con una distribución de tamaño mixta. Para determinar el diámetro de las partículas individuales, extraemos el perfil transversal a través de las partículas, como se muestra en la Fig. 1C. A partir del perfil de altura, observamos variaciones nanoscópicas en la altura en la dirección normal a la superficie del grafeno para diferentes partículas (perfil transversal marcado con líneas blancas en la Fig. 1B). La anchura observada de las partículas a partir de los datos brutos del AFM es una convolución entre la punta del AFM y el radio de la partícula esférica y es mayor que la anchura real de la partícula. Sin embargo, la altura medida no depende de la geometría de la punta de AFM, y como la altura es igual al diámetro de las partículas esféricas, es entonces posible estimar el diámetro de las partículas como los oligómeros amiloides (27) y de los objetos cilíndricos de alta relación de aspecto como las fibrillas amiloides (39). Sobre la base de mediciones de perfil de altura similares extraídas a lo largo de cientos de partículas individuales atribuidas previamente como oligómeros amiloides (27, 36, 40), la partícula más pequeña (asumiendo una forma esférica) que hemos podido detectar en el estudio actual para la isoforma Aβ-40 tiene un diámetro de ~1,65 nm, comparable a los informes anteriores de AFM de péptidos Aβ-40 (28). Para estimar el número de monómeros de Aβ en las partículas medidas en nuestro estudio, nos basamos en el método propuesto por Erickson (41) para convertir el volumen agregado medido en peso molecular asumiendo una forma esférica para las partículas individuales de Aβ. Sobre la base de esta suposición, estimamos que la partícula más pequeña de Aβ-40 de un diámetro medio de 1,9 ± 0,25 nm corresponde a un peso molecular de ~3,0 kDa, que corresponde aproximadamente a un monómero. Aplicamos el mismo protocolo de conversión para estimar el peso molecular de las partículas de Aβ-42 medido a través de AFM.

Fig. 1 Imagen de los péptidos Aβ-40 y Aβ-42 durante las primeras etapas de agregación.

(A) Estructuras de RMN helicoidales parcialmente plegadas de Aβ-40 y Aβ-42 en solución acuosa. Las regiones específicas de ambos péptidos están coloreadas en rojo para el extremo N (residuos 1 a 16), en gris para el grupo hidrofóbico central (17 a 21), en azul para el giro (22 a 29) y en verde para el extremo C (30 a 42). Todas las cadenas laterales hidrofóbicas se representan como palos grises. (B) Imagen topográfica de AFM de alta resolución de pequeños oligómeros de Aβ-40 escasamente distribuidos y adsorbidos sobre grafeno. Las partículas esféricas de varios diámetros son visibles a partir de la imagen de AFM codificada por colores. (C) Perfil de altura transversal extraído a lo largo de unas pocas partículas individuales que muestra las diferencias de altura de las partículas espacialmente bien resueltas. (D) Imagen de AFM de oligómeros de Aβ-42 densamente distribuidos y adsorbidos en el grafeno. (E) Análisis de altura transversal de los oligómeros de Aβ-42 densamente adsorbidos, a lo largo de la línea verde indicada en la imagen de AFM mostrada en (D). Sobre la base de los trazos de altura medidos en 200 oligómeros individuales de Aβ-40 y Aβ-42, extraemos un diámetro medio de partícula de (4,1 ± 1,1) nm para Aβ-40 y un diámetro medio de (8,4 ± 2,1) nm para Aβ-42 . Los datos de AFM (B y D) y los datos estadísticos (F) se registraron después de incubar la solución de amiloide (Aβ-40 y Aβ-42) durante 30 min en condiciones estándar de laboratorio a (24 ± 1)°C.

A continuación, comparamos la distribución del tamaño y la morfología de los agregados de Aβ-42 con idéntica concentración (5 μM), condiciones de tampón (PBS) (pH 7.4), el tiempo de incubación (0,5 horas) y las condiciones de deposición (10-μl de volumen de solución de Aβ-42, 5 minutos de tiempo de deposición, seguido de un enjuague de la superficie con 5 ml de agua pura) que se utilizaron para obtener imágenes de Aβ-40. La Figura 1D es una imagen topográfica de AFM de partículas de Aβ-42 clasificadas como oligómeros de estudios anteriores (24, 25). Las partículas de Aβ-42 están presentes en diámetros variables como se muestra en el perfil transversal de la Fig. 1E (extraído a lo largo de la línea indicada en la Fig. 1D) y son visiblemente más grandes y más densamente pobladas para Aβ-42 que para los oligómeros de Aβ-40 (Fig. 1B) incubados durante el mismo período de tiempo (0,5 horas). El oligómero más pequeño que hemos podido medir con un AFM para la isoforma Aβ-42 tenía un diámetro medio de 3,7 ± 0,2 nm, que corresponde a un peso molecular de ~25,0 kDa que corresponde aproximadamente a un hexámero. Sobre la base del análisis del perfil de altura realizado en ~200 oligómeros individuales de Aβ-40 y Aβ-42, extraemos un diámetro medio de (4,1 ± 1,1) nm para Aβ-40 (Fig. 1F, histograma de barra roja superior) y (8,4 ± 2,1) nm para Aβ-42 (Fig. 1F, histograma de barra verde inferior). Los datos cualitativos (imágenes de topografía de AFM) y cuantitativos (distribución de diámetros a partir del perfil de altura) de nuestro análisis son coherentes con las observaciones anteriores de que Aβ-42 tiende a agregarse más rápidamente que los péptidos Aβ-40 (3, 24, 27, 36, 38, 42).

Para justificar las mediciones en agua en lugar de en tampón PBS, comparamos la distribución de tamaños de los oligómeros Aβ-40 y Aβ-42 tanto en PBS como en agua pura. Comparando las distribuciones estadísticas del diámetro de las partículas (inferidas a partir del análisis de trazos de altura) para oligómeros individuales de Aβ-40 y Aβ-42 (mismo tiempo de incubación de 1 hora) tanto en tampón PBS como en agua pura, se encuentran valores de diámetro más altos para las partículas medidas en tampón PBS que en agua pura (véase la fig. S3, A y B, para los gráficos estadísticos detallados). Aquí, atribuimos el aumento medido en el diámetro medio de las partículas para los oligómeros Aβ-40 y Aβ-42 adsorbidos en el grafeno en la solución tampón PBS a la contaminación de la sonda de AFM en la solución salina tampón, lo que podría conducir a la sobreestimación de la morfología real de los oligómeros resultando así en valores de tamaño de partícula inflados. Confirmamos esta hipótesis al revelar la contaminación de la punta de AFM durante la obtención de imágenes de los agregados amiloides en tampón PBS (véase la fig. S2 para las imágenes de AFM de las estrías de la punta y los efectos de la doble punta en el medio de tampón PBS). Para medir con precisión el diámetro de los agregados oligoméricos con resolución de una sola partícula, continuamos realizando mediciones de AFM en agua pura y en grafeno atómicamente limpio. La figura 2 es un gráfico de la evolución del diámetro de los oligómeros a lo largo del tiempo. Cada punto del gráfico se basa en los perfiles transversales extraídos de los cientos de oligómeros individuales en numerosos intervalos de tiempo de incubación que van de 0,5 a 110 horas para Aβ-40 (curva roja) y Aβ-42 (curva verde) adsorbidos en la interfaz grafeno-agua. En el gráfico (Fig. 2) se observa un aumento general del diámetro del oligómero para ambas isoformas peptídicas, con un diámetro de oligómero globalmente mayor para Aβ-42 en comparación con Aβ-40. No observamos la presencia generalizada de agregados oligoméricos para la especie Aβ-40 después de ~80 horas de tiempo de incubación, mientras que en el caso de Aβ-42, los agregados oligoméricos seguían estando presentes en abundancia incluso después de ~110 horas de tiempo de incubación según el análisis de datos de AFM (Fig. 4G). Este resultado sugiere que los oligómeros de bajo peso molecular de Aβ-42 persisten más tiempo durante la agregación que los oligómeros de Aβ-40. Las estructuras MD computadas que se presentan más adelante (Fig. 6) cuantifican aún más las interacciones entre los oligómeros de Aβ-42 y la superficie de grafeno subyacente. Al monitorizar los cambios en la morfología de los oligómeros a lo largo del tiempo, también detectamos la formación de agregados fibrilares para ambas especies de Aβ-40 y Aβ-42. La Figura 3A es una topografía de AFM que registra los primeros signos de la aparición de los agregados fibrilares a lo largo de la vía de agregación de Aβ-40 después de incubar la solución de amiloide durante 30 horas (indicado por la flecha negra en el gráfico de la Fig. 2). Estos agregados fibrilares tenían una altura variable como se muestra en los perfiles transversales de la Fig. 3B extraídos a lo largo de las líneas negras indicadas en la imagen de altura de AFM (Fig. 3A). Estos agregados fibrilares se observaron junto con los agregados oligoméricos (véase la sección S2 para las imágenes de AFM adquiridas sobre otras áreas de la misma muestra) mostrando la presencia de una mezcla de fibrillas y agregados oligoméricos. A partir de los perfiles de altura de AFM medidos sobre varios filamentos individuales, como se muestra en la Fig. 3A, observamos que el diámetro (inferido a partir de la altura) de estos objetos varía de ~3 a 8 nm, lo que concuerda con los valores de diámetro medidos con AFM para agregados fibrilares de Aβ-40 adsorbidos sobre silicio limpio (28). En el pasado, estos agregados fibrilares con morfología nodular que se producen durante las primeras etapas del ensamblaje amiloide se han clasificado como protofibrillas, que son intermedias en la vía de fibrilación amiloide y precursoras de las fibrillas maduras (22, 27, 36, 40).

Fig. 2 Caracterización de los oligómeros de Aβ-40 y Aβ-42 desde 0,5 hasta 120 horas de incubación.

Ploteo del diámetro de las partículas (obtenido a partir del análisis del perfil de altura de las partículas individuales) aumento con el tiempo para los oligómeros de Aβ-40 (curva roja) y Aβ-42 (curva verde) (adsorbidos en la interfaz grafeno-agua) en función del tiempo de agregación de Aβ. En el caso de Aβ-40, se observaron agregados oligoméricos con una distribución de tamaño cuantificable en las imágenes de AFM hasta ~80 horas. En el caso del Aβ-42, se observaron y detectaron oligómeros estables durante las imágenes de AFM incluso después de ~80 horas de tiempo de incubación y también fueron visibles en las imágenes de AFM registradas incluso a ~110 horas de tiempo de incubación. Las flechas negras denotan los puntos temporales en los que se observaron las primeras protofibrillas para Aβ-40 (~30 horas) y Aβ-42 (~8 horas) y la fibrilla madura observada a través de las imágenes de AFM para Aβ-42 (~90 horas).

Fig. 3 Inicio de imágenes de agregados fibrilares de Aβ-40 y Aβ-42.

(A) Imagen de AFM que muestra la presencia de protofibrillas de Aβ-40 escasamente adsorbidas con variaciones de altura visibles a partir de la imagen de altura codificada por colores. Las protofibrillas de Aβ-40 se observaron por primera vez cuando la solución de amiloide se incubó a temperatura ambiente durante 30 horas. (B) El análisis de la sección extraída a lo largo de las líneas negras indicadas en la imagen de AFM mostrada en (A) muestra las diferencias en los perfiles de altura de las protofibrillas de Aβ-40. (C) Imagen de AFM que muestra la presencia de agregados oligoméricos de Aβ-42 densamente distribuidos y estructuras protofibrilares. La formación de protofibrillas de Aβ-42 se observó por primera vez tras incubar la solución de Aβ-42 durante 8 horas. (D) Perfil de altura extraído a lo largo de las líneas negras indicadas en (C) sobre las protofibrillas de Aβ-42. (E) Imagen de AFM de gran superficie que muestra la formación de estructuras planas, protofibrillas y la presencia de partículas oligoméricas cuando se incubó Aβ-42 durante 30 horas y luego se depositó sobre grafeno para obtener imágenes de AFM. (F) Análisis estadístico de la distribución de la altura de las protofibrillas para Aβ-40 (histograma rojo superior) después de 30 horas de incubación de la solución amiloide y (G) Aβ-42 (histograma verde inferior) después de 8 horas de tiempo de incubación a temperatura ambiente. El recuadro en (F) es una imagen tridimensional de AFM de las protofibrillas de Aβ-40 (tamaño, 580 nm por 300 nm), y el recuadro en (G) es una imagen tridimensional de AFM de las protofibrillas de Aβ-42 (tamaño, 550 nm por 650 nm).

La formación de protofibrillas de Aβ-40 (con una estructura nodular característica) se observó por primera vez tras 30 horas de tiempo de incubación, mientras que la formación de protofibrillas para Aβ-42 se detectó tras sólo 8 horas. La Figura 3C es una imagen de AFM que muestra la presencia de oligómeros junto con una población menor de agregados fibrilares de Aβ-42 con alturas variables, como se muestra en la Fig. 3D. Esta diferencia en la velocidad de agregación y en las estructuras protofibrilares resultantes confirma que las isoformas de Aβ-42 se agregan más rápidamente en solución que el Aβ-40. Junto con los agregados oligoméricos y las protofibrillas simples, observamos estructuras de tipo lámina plana compuestas por protofibrillas alineadas localmente después de ~30 horas de incubación de Aβ-42 (véase la Fig. 3E y la sección S3 para una mayor caracterización por AFM de las protofibrillas). Anteriormente, se informó de la aparición de estructuras similares de tipo hoja de Aβ-42 que interactúan lateralmente en grafito resueltas mediante AFM (30). Para cuantificar las diferencias de altura para las primeras protofibrillas de Aβ-40 y Aβ-42 observadas, que aparecen en diferentes intervalos de tiempo de incubación, realizamos un análisis estadístico (Fig. 3F) de las alturas de ~350 protofibrillas individuales para cada especie. Sobre la base de la distribución de alturas, calculamos alturas medias de protofibrillas de (3,9 ± 1,6) nm y (5,5 ± 1,5) nm para Aβ-40 (Fig. 3F, histograma rojo superior) y Aβ-42 (Fig. 3F, histograma verde inferior), respectivamente. El siguiente cambio en la morfología que observamos durante la agregación amiloide es la formación de fibrillas maduras con su estructura alargada. La estructura atómica de las fibrillas maduras de Aβ-40 (10, 43) y Aβ-42 (44, 45) se ha conocido a partir de la criomicroscopía electrónica (43, 44) y la RMN en estado sólido (45). Sin embargo, las diferencias en las características físicas, como la altura y la longitud de las fibrillas maduras de Aβ-40 y Aβ-42 que se producen en distintos intervalos de tiempo de incubación, que pueden estar influidas por factores ambientales (46), siguen sin catalogarse completamente en condiciones ambientales.

En las condiciones utilizadas en este estudio, las fibrillas maduras agregadas en solución aparecieron por primera vez para Aβ-40 después de 110 horas y a unas 90 horas de tiempo de incubación para Aβ-42. La Figura 4A es una imagen de altura de AFM de gran superficie de las fibrillas maduras de Aβ-40 que aparecen como fibrillas individuales curvadas (indicadas con flechas rojas) y alargadas (indicadas con flechas azules). Además de las fibrillas individuales con un diámetro medio de (8,5 ± 0,5) nm (diámetro de la fibrilla inferido a partir del trazado de la altura asumiendo una morfología cilíndrica para las fibrillas; véase la sección S4 para las estadísticas de altura de las fibrillas de Aβ-40 maduras), también observamos, a partir de la imagen topográfica y de la imagen de AFM de contraste de fase adquirida simultáneamente (Fig. 4B), la presencia de uniones (indicadas con flechas amarillas en la Fig. 4A) desde las que se ramifican las fibrillas individuales. No detectamos ninguna presencia prevalente de agregados oligoméricos junto con las fibrillas maduras de Aβ-40, como se evidencia en la imagen de altura, fase y superposición (Fig. 4C). A continuación, resolvemos la aparición de fibrillas maduras de Aβ-42 observadas por primera vez después de 90 horas de incubación, como se muestra en la imagen de altura de AFM de alta resolución (Fig. 4D) y de contraste de fase (Fig. 4E). La topología de las fibrillas maduras observada para Aβ-42 difiere notablemente de la topología previamente observada de las fibrillas maduras de Aβ-40 (Fig. 3A). Las fibrillas maduras de Aβ-42 están estrechamente empaquetadas, alineadas direccionalmente, y aparecen como estructuras cilíndricas rígidas muy diferentes de las fibrillas maduras de Aβ-40 curvadas y aisladas. Esta observación también se confirma con el análisis del perfil transversal (Fig. 4F). En concreto, la línea verde indicada en la Fig. 4D revela el perfil lateral estrechamente empaquetado de las fibrillas de Aβ-42 maduras. Sobre la base del análisis seccional a lo largo de ~200 fibrillas maduras individuales, calculamos que el diámetro medio de las fibrillas de Aβ-42 maduras es de (9,6 ± 0,7) nm (véase la fig. S6A para las estadísticas de altura de las fibrillas de Aβ-42 maduras).

Fig. 4 Diferencias morfológicas entre las redes de fibrillas de Aβ-40 y Aβ-42.

Imagen de AFM de la información de altura (A) y fase (B) de las fibrillas maduras de Aβ-40 depositadas de forma dispersa, obtenidas por imágenes después de incubar la solución de amiloide durante 110 horas. Las fibrillas aparecen tanto como formas curvas interconectadas como individuales alargadas. (C) Superposición de datos de altura (A) y de fase (B). Las flechas amarillas en (A) indican la primera aparición de racimos que están presentes dentro de las fibrillas Aβ-40 escasamente conectadas. (D y E) Imagen de AFM de alta resolución de altura y contraste de fase de fibrillas Aβ-42 alineadas. (F) Perfil de altura transversal medido a lo largo de la línea verde indicada en la imagen de altura de AFM mostrada en (D). Las fibrillas de Aβ-42 maduras se observaron por primera vez después de incubar la solución de amiloide durante 90 horas a temperatura ambiente. La disposición de las fibrillas de Aβ-42 es claramente diferente del patrón de adsorción mostrado por Aβ-40 (A). Las fibrillas maduras de Aβ-42 aparecen como varillas rígidas apiladas adyacentes con pliegues pero sin dobleces. (G) Imagen de AFM de contraste de fase de gran superficie de las fibrillas de Aβ-42 maduras observadas tras 90 horas de incubación a temperatura ambiente. Las imágenes de AFM espacialmente bien resueltas de las fibrillas de Aβ-42 maduras (D, E y G) también revelan la presencia de partículas oligoméricas (indicadas por flechas blancas).

Una inspección más detallada de los datos de altura y de la imagen de AFM de contraste de fase revela la existencia de agregados oligoméricos esféricos junto con las fibrillas maduras en esta etapa de agregación de Aβ-42. La población prevalente de agregados oligoméricos es distinguible en la imagen de contraste de fase (Fig. 4G). Además de proporcionar evidencia cualitativa de la existencia de agregados oligoméricos hacia la fase de saturación del ensamblaje amiloide , también cuantificamos la distribución del tamaño de estos agregados oligoméricos basándonos en el análisis del perfil de altura realizado en ~100 agregados oligoméricos individuales. Caracterizamos las partículas presentes después del inicio de las fibrillas maduras (90 horas) hasta el punto en que los oligómeros ya no fueron detectados directamente por el AFM (110 horas). La Figura 5A muestra la distribución del diámetro de los agregados oligoméricos presentes a las 90, 95, 100, 105 y 110 horas de incubación. Estos datos identifican una distribución de diámetro estrecho de agregados en el rango de tamaño de ~7 a 9 nm (correspondiente a un peso molecular de 221 ± 80 kDa que corresponde aproximadamente a un 50-mer esférico) que tienden a coexistir con fibrillas maduras para Aβ-42. Las fibrillas densas aparecieron durante las etapas finales de la fibrilogénesis de Aβ-40 y Aβ-42. La Figura 5B es una imagen de altura de AFM de gran superficie que revela la topología a nanoescala del ensamblaje de fibrillas de Aβ-40 maduras en la interfaz grafeno-agua cuando la solución de amiloide se incubó durante 150 horas. Los agregados fibrilares de Aβ-40 maduros se forman sin alineación direccional, como se puede ver tanto en la imagen de altura como en la de contraste de fase correspondiente (Fig. 5C). Sobre la base de los datos de AFM obtenidos desde el inicio de las fibrillas maduras (Fig. 4A) hasta el estado final de agregación (Fig. 5B; nótese que la topología de las fibrillas estrechamente empaquetadas no sufre un cambio drástico más allá de las 150 horas de incubación), observamos la formación de racimos compuestos por fibrillas agrupadas. Estas agrupaciones están, a su vez, conectadas por una pequeña población de fibrillas alargadas escasamente distribuidas con una altura media de (8,8 ± 1,2) nm. El siguiente cambio morfológico distinto a lo largo de la vía de agregación de Aβ-42 se observó después de ~130 horas de incubación, que es anterior a la aparición de las fibrillas de Aβ-40 maduras a las 110 horas. La Figura 5D es una imagen de altura de gran superficie de las fibrillas de Aβ-42 maduras tras un tiempo de incubación de 150 horas. La imagen de contraste de fase (Fig. 5E) revela detalles intrigantes de la densa morfología de las fibrillas. Se observó que las fibrillas de Aβ-42 estaban alineadas cuando se incubó la solución amiloide durante 110 horas (Fig. 4G). Estas estructuras fibrilares alineadas persistieron durante un tiempo de incubación más largo hasta ~250 horas sin cambios drásticos en la morfología de las fibrillas, lo que sugiere que las etapas finales de la vía de agregación de las fibrillas de Aβ-42 ya se alcanza después de aproximadamente 130 horas. La figura 5 (F y G) es la imagen de altura y contraste de fase adquirida en una de estas regiones fibrilares de Aβ-42 alineadas tras 150 horas de incubación.

Fig. 5 Etapas finales de la agregación de Aβ-40 y Aβ-42.

(A) Análisis estadístico de la distribución del diámetro (basado en el perfil de altura extraído en cada Aβ-42) de los oligómeros presentes en las etapas finales de la agregación de Aβ-42 cuando la solución de amiloide se incubó a las 90, 95, 100, 105 y 110 horas. Las regiones sombreadas en gris en cada gráfico destacan la presencia de partículas oligoméricas de un rango de diámetro de ~7 a 9 nm en los tiempos de incubación más largos. Imagen de altura AFM (B) y de contraste de fase (C) de la morfología de las fibrillas de Aβ-40 maduras (tras 150 horas de incubación) que muestra una red dispersa. La morfología del racimo con fibrillas se revela mejor en la imagen de fase (C). Imagen de altura (D) y de fase (E) de las fibrillas maduras de Aβ-42 obtenidas tras incubar la solución amiloide durante 150 horas. Las fibrillas maduras de Aβ-42 aparecían alineadas, lo que contrasta con la topología de las fibrillas maduras de Aβ-40 incubadas durante el mismo periodo de tiempo de 150 horas (B). Imágenes de altura (F) y de fase (G) ampliadas espacialmente de las redes fibrilares de Aβ-42 (después de incubar la solución de amiloide durante 180 horas) que muestran la alineación significativa de las fibrillas maduras.

Las fibrillas de Aβ-42 siguen siendo notablemente diferentes de la topología de los agregados fibrilares de las especies de Aβ-40 incubadas durante el mismo periodo de tiempo (Fig. 5B). Las imágenes de alta resolución confirman además la alineación de las fibrillas con una altura media de (9,5 ± 1,1) nm que es ligeramente mayor que la altura media medida para las fibrillas de Aβ-40 maduras. Para comprobar si este efecto de alineación se produce debido a las interacciones interfibrilares más fuertes o al ensamblaje mediado por el grafeno, depositamos 10 μl de péptido Aβ-42 en un portaobjetos de vidrio limpio (véase Materiales y Métodos para el procedimiento de limpieza y la verificación) utilizando el mismo protocolo de deposición y obtención de imágenes utilizado para los estudios de adsorción de Aβ-42 en el grafeno y se obtuvieron imágenes en agua y en medio de tampón PBS. Las imágenes de AFM registradas para las especies de Aβ-42 tras 150 horas de incubación en la interfaz vidrio-agua y vidrio-PBS mostraron una morfología de red muy similar a la observada en la interfaz grafeno-agua (véase la sección S5). También se observó que las fibrillas de Aβ-42 maduras mostraban una alineación en el portaobjetos de vidrio cuando se obtuvieron imágenes en la solución tampón y después de enjuagar y obtener imágenes de la superficie con agua. La alineación fibrilar observada en el vidrio indica que la hidrofilia y la rugosidad de la superficie de obtención de imágenes no son los factores dominantes responsables de la ordenación de largo alcance de las fibrillas de Aβ-42. La observación de la alineación fibrilar para las fibrillas de Aβ-42 maduras y no para los agregados fibrilares de Aβ-40 preparados de forma idéntica puede deberse a los residuos de aminoácidos adicionales presentes solo para los péptidos de Aβ-42 (8, 27) que podrían promover las interacciones interfibrilares. Recientemente se ha demostrado que Ala42, ausente en Aβ-40, forma un puente salino con Lys28, (45) amortiguando así la carga neta presente en la superficie de las fibrillas de Aβ-42 (48). Información emergente sobre la estructura atómica de las fibrillas de Aβ-42 (48) junto con nuestras observaciones de AFM de, en promedio, fibrillas de Aβ-42 más largas y entre los dos monómeros centrales (C, negro). (E) Distribución de las alturas máximas de los dodecámeros muestreados por encima de la lámina de grafeno durante las simulaciones.

Para identificar la orientación preferida de los dodecámeros en la superficie del grafeno, calculamos las energías de unión dodecámero-grafeno. A partir de la fig. S9B, encontramos que las energías de unión calculadas (ΔEbinding) muestran una preferencia orientativa tanto para Aβ-40 como para Aβ-42 que corresponde a una propensión de los dodecámeros a lo largo de la lámina de grafeno con los dos pliegues adyacentes entre sí, lo que favorece el alargamiento de la fibrilla. La descomposición de los valores de unión de ΔE (fig. S9B) muestra que las diferencias se originan en las energías de unión de solvatación polar. ΔEpolar es negativo para la orientación de siembra de fibrillas preferida pero positivo para los otros dos planos, tanto en Aβ-40 como en Aβ-42, lo que indica que el agua interfacial oligómero-grafeno juega un papel crucial en la estabilización de este modo de adsorción. Animados por los hallazgos anteriores, ampliamos las simulaciones con esta orientación preferida (marcada como III) hasta 0,5 μs. Los análisis (a menos que se indique lo contrario) se basan en los últimos 200 ns de dinámica libre (la fig. S9 muestra la línea de tiempo de la fracción de contactos nativos). Aβ-42 y Aβ-40 adoptan modos de adsorción muy similares con un número casi idéntico de contactos con el grafeno . El recuadro inferior de la fig. S9D muestra que el residuo Tyr10 tanto en los dodecámeros de Aβ-40 como de Aβ-42 muestra contactos estables con el grafeno sin participación de los dos residuos C-terminales adicionales en Aβ-42, lo que confirma que los residuos Iso41 y Ala42 conservan sus contactos interfold en todo momento.

La figura 6A muestra conformaciones estables representativas (según se deduce de las comparaciones en un rango de orientaciones de unión; véase la fig. S9) de las estructuras de Aβ-40 y Aβ-42 12-mer en la interfaz grafeno-agua en vistas frontal y lateral. Podemos comparar aproximadamente las energías conformacionales calculadas (fig. 6B) normalizando por monómero, que predicen que los dodecámeros de Aβ-42 son más estables (en ~35 kcal/mol) que los de Aβ-40 cuando se alinean en la orientación de alargamiento de la fibrilla. Esta preferencia calculada es coherente con la agregación más rápida de Aβ-42 observada en nuestro estudio de AFM y en investigaciones anteriores de la agregación de Aβ-42, junto con la persistencia de oligómeros para Aβ-42. La mayor contribución a la energía conformacional global proviene de la energía libre de solvatación polar del dodecámero (fig. S9E), que es solo ligeramente más favorable para Aβ-42 que para Aβ-40. La contribución del disolvente va unida a una energía electrostática de Coulomb considerablemente más desfavorable (positiva) para Aβ-40, lo que indica que las repulsiones carga-carga intramoleculares contribuyen significativamente a la inestabilidad general observada para Aβ-40. Un hallazgo potencialmente interesante de nuestras simulaciones es la aparente diferencia en la aparición de enlaces de hidrógeno «prefibrilares» dentro del registro (enlaces H) entre los dos extremos del dodecámero tanto para Aβ-40 como para Aβ-42 en la interfaz grafeno-agua (Fig. 6, C y D, y tabla S1, y véase también la sección S6). Algunos experimentos anteriores han informado de que el crecimiento de las fibrillas de Aβ es unidireccional (58, 59), mientras que otros han destacado el crecimiento bidireccional (60, 61). El crecimiento unidireccional de la fibrilla se ha atribuido a las diferencias en la unión H entre los dos extremos de la fibrilla expuestos al disolvente (siendo un extremo menos fluctuante y, por tanto, más cerrado y más estable que el otro) tanto para Aβ-40 como para Aβ-42, a partir de estudios previos de simulación MD (62). Sin embargo, no se sabe qué extremo promueve realmente la adición de monómeros en las fibrillas, aunque las simulaciones han demostrado que los extremos cerrados pueden extenderse más rápidamente que los abiertos (63). A partir de nuestro análisis de los dímeros de los dos extremos (designados como E1 y E2) expuestos al agua y de los dímeros centrales a granel (denotados como C) del dodecámero, encontramos que el número de enlaces H dentro del registro en un extremo (E1) es significativamente menor que el del otro extremo (E2) tanto para el Aβ-40 como para el Aβ-42, identificando un potencial para experimentar un crecimiento unidireccional. Sin embargo, se registra una diferencia del 11% (véase la tabla S1 y la sección S6) para los enlaces H más fuertes (≥80%) entre E2 y E1 para Aβ-42, mientras que se registra una diferencia significativamente mayor del 19% para Aβ-40, lo que implica que las dodecámeras de Aβ-40 están más abiertas (casi el doble que para Aβ-42) en el extremo fluctuante. La adición de monómeros en el extremo E1 puede proceder de forma más ordenada en el caso de Aβ-42 que en el de Aβ-40, y debido a la menor diferencia (por un factor de 2) entre los dos extremos de Aβ-42 en comparación con los de Aβ-40, esta predicción de modelado podría ponerse a prueba en futuros experimentos de AFM resueltos en el tiempo.

Como se ha destacado anteriormente, el puente salino recientemente informado entre la cadena lateral amino de Lys28 y el extremo C de Ala42 en la estructura de la fibrilla de Aβ-42 desempeña un papel en la estabilización del pliegue de la fibrilla en forma de S (45). La estructura nativa de Aβ-42 que tiene el pliegue en forma de S utilizada en este estudio no tiene un puente salino completo Lys28-Ala42. Para identificar las interacciones que son específicas de Ala42 en los dodecámeros «en forma de fibrilla» de Aβ-42, pero no de Aβ-40, calculamos los contactos de residuos intra e intercadena (véase la sección S6 y la fig. S10). La figura S10A representa la organización de la cadena en un típico pliegue dodecámero en forma de LS de Aβ-42 marcado de la A a la L. Las frecuencias de contacto de átomos pesados en el sentido de la cadena de los residuos dentro de una distancia de 0,5 nm revelan que Ala42 hace frecuentes (>50%) contactos intracadena con Lys28 (marcado por círculos negros en la mitad derecha del mapa) y es el único contacto intramonomérico que hace Ala42 en el dodecámero Aβ-42. Ala42 también experimenta contactos intercadena con Lys28 a lo largo del eje de la fibrilla (marcado por círculos rojos). Ambos contactos intra e intercadena podrían desempeñar un papel en la estabilización de Aβ-42 que implica Ala42, que está ausente en Aβ-40. La figura S10C muestra una estructura representativa del dodecámero en la que la cadena lateral NH3+ de Lys28 y el COO- terminal de Ala42 permanecen muy próximos. La relevancia física de los contactos Lys28-Ala42 para el pliegue LS se evaluó además calculando la distribución de distancias entre el amino N de la cadena lateral de Lys28 y el carboxilato C de Ala42 para cada cadena del dodecámero (fig. S10D). Estos contactos alcanzan un pico de 0,5 nm para la mayoría de las cadenas, lo que indica que el fuerte contacto entre Lys28 y Ala42 (que falta en Aβ-40) puede hacer que Aβ-42 sea más estable respecto a los dodecámeros de Aβ-40 y podría desempeñar un papel adicional para garantizar una fuerte alineación de las fibrillas de Aβ-42, como se observa en nuestras imágenes de AFM. Por último, la distribución calculada de las alturas máximas de las dodecámeras en la parte superior del grafeno a partir de nuestras simulaciones muestra un rango de ~7 a 11 nm para Aβ-42 (Fig. 6E, curva roja) con un pico de ~8 nm para los ensamblajes de dodecámeras modelados no esféricos y en capas. Los valores de altura global obtenidos para el dodecámero Aβ-42 a partir de las simulaciones son comparables a los valores de altura media de las partículas medidos experimentalmente de (5,8 ± 1,0) nm (véase la fig. S3B, gráfico estadístico verde superior), que corresponde a un peso molecular de ~55 kDa.

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