Kompletny szlak agregacji amyloidu β (1-40) i (1-42) rozwiązany na atomowo czystym interfejsie

WYNIKI

Rysunek 1A przedstawia struktury uzyskane wcześniej z magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) monomeru Aβ-40 i monomeru Aβ-42 w roztworze. Te dwie izoformy różnią się długością sekwencji peptydowej, przy czym Aβ-42 posiada dwie dodatkowe reszty aminokwasowe (Iso41 i Ala42) w porównaniu z Aβ-40, co powoduje obserwowaną szybszą agregację Aβ-42 (38). Roztwory Aβ-40 i Aβ-42 przygotowywano w roztworze buforowym PBS (pH 7,4), a do każdego eksperymentu obrazowania AFM, 10 μl roztworu amyloidu odlewano kroplami na atomowo czysty grafen (szczegóły dotyczące przygotowania i osadzania Aβ-40 i Aβ-42 oraz protokoły czyszczenia grafenu znajdują się w Materiałach i Metodach). Pięć minut po osadzeniu roztworu amyloidu, powierzchnię grafenu przepłukiwano 5 ml czystej wody w celu usunięcia nadmiaru roztworu buforowego i zapobieżenia adsorpcji niezwiązanych peptydów na powierzchni lub końcówce AFM (szczegóły dotyczące obrazowania AFM w zamkniętej komorze cieczowej – patrz Materiały i Metody). Rysunek 1B przedstawia obraz AFM zarejestrowany po osadzeniu roztworu peptydu Aβ-40 (inkubowanego przez 0,5 godziny) na epitaksjalnym grafenie i zobrazowany w czystej wodzie. Obraz wysokości AFM wskazuje na obecność pojedynczych cząstek o mieszanym rozkładzie wielkości. Aby określić średnicę pojedynczych cząstek, wyodrębniamy profil przekroju poprzecznego cząstek, jak pokazano na Rys. 1C. Z profilu wysokości obserwujemy nanoskopowe zmiany wysokości w kierunku normalnym do powierzchni grafenu dla różnych cząstek (profil przekroju poprzecznego zaznaczony białymi liniami na Rys. 1B). Zaobserwowana szerokość cząstek z surowych danych AFM jest złożeniem pomiędzy końcówką AFM a promieniem cząstki sferycznej i jest większa niż prawdziwa szerokość cząstki. Jednakże, zmierzona wysokość nie zależy od geometrii końcówki AFM, a ponieważ wysokość równa się średnicy cząstek sferycznych, możliwe jest oszacowanie średnicy cząstek takich jak oligomery amyloidu (27) oraz obiektów cylindrycznych o wysokim współczynniku przenikania, takich jak fibryle amyloidu (39). Na podstawie podobnych pomiarów profilu wysokości wyodrębnionych wzdłuż setek pojedynczych cząstek wcześniej przypisanych jako oligomery amyloidu (27, 36, 40), najmniejsza cząstka (zakładając kształt sferyczny), którą udało nam się wykryć w obecnym badaniu dla izoformy Aβ-40 ma średnicę ~1,65 nm, porównywalną z wcześniejszymi doniesieniami AFM o peptydach Aβ-40 (28). Aby oszacować liczbę monomerów Aβ w cząsteczkach zmierzonych w naszym badaniu, opieramy się na metodzie zaproponowanej przez Ericksona (41), aby przeliczyć zmierzoną objętość agregatu na masę cząsteczkową, zakładając kulisty kształt pojedynczych cząsteczek Aβ. Na podstawie tego założenia szacujemy, że najmniejsza cząstka Aβ-40 o średniej średnicy 1,9 ± 0,25 nm odpowiada masie cząsteczkowej ~ 3,0 kDa, co w przybliżeniu odpowiada monomerowi. Stosujemy ten sam protokół konwersji do oszacowania masy cząsteczkowej cząsteczek Aβ-42 mierzonej za pomocą AFM.

Następnie porównaliśmy rozkład wielkości i morfologię agregatów Aβ-42 o identycznym stężeniu (5 μM), warunkach buforowych (PBS) (pH 7.4), czasie inkubacji (0,5 godziny) i warunkach osadzania (10-μl objętości roztworu Aβ-42, 5-minutowy czas osadzania, a następnie spłukanie powierzchni 5 ml czystej wody), jak w przypadku obrazowania Aβ-40. Rysunek 1D jest topograficznym obrazem AFM cząstek Aβ-42 sklasyfikowanych jako oligomery z poprzednich badań (24, 25). Cząsteczki Aβ-42 są obecne w różnych średnicach, jak pokazano na profilu przekroju poprzecznego na ryc. 1E (wyodrębnionym wzdłuż linii wskazanej na ryc. 1D) i są wyraźnie większe i gęściej zaludnione w przypadku Aβ-42 niż w przypadku oligomerów Aβ-40 (ryc. 1B) inkubowanych przez ten sam okres czasu (0,5 godziny). Najmniejszy oligomer, jaki udało nam się zmierzyć za pomocą AFM dla izoformy Aβ-42 miał średnią średnicę 3,7 ± 0,2 nm, co odpowiada masie cząsteczkowej ~25,0 kDa, która w przybliżeniu odpowiada heksamerowi. Na podstawie analizy profilu wysokości przeprowadzonej na ~200 pojedynczych oligomerach Aβ-40 i Aβ-42, wyodrębniamy średnią średnicę (4,1 ± 1,1) nm dla Aβ-40 (ryc. 1F, histogram górnego czerwonego paska) i (8,4 ± 2,1) nm dla Aβ-42 (ryc. 1F, histogram dolnego zielonego paska). Jakościowe (obrazy topografii AFM) i ilościowe (rozkład średnicy z profilu wysokości) dane z naszej analizy są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami, że Aβ-42 ma tendencję do agregacji szybciej niż peptydy Aβ-40 (3, 24, 27, 36, 38, 42).

Aby uzasadnić pomiary w wodzie zamiast w buforze PBS, porównaliśmy rozkład wielkości oligomerów Aβ-40 i Aβ-42 zarówno w PBS, jak i w czystej wodzie. Porównując rozkłady statystyczne średnicy cząstek (wywnioskowane z analizy śladu wysokości) dla pojedynczych oligomerów Aβ-40 i Aβ-42 (ten sam czas inkubacji 1 godzina) zarówno w buforze PBS, jak i w czystej wodzie, wyższe wartości średnicy występują dla cząstek mierzonych w buforze PBS niż w czystej wodzie (patrz fig. S3, A i B, dla szczegółowych wykresów statystycznych). Tutaj przypisujemy zmierzony wzrost średniej średnicy cząstek dla oligomerów Aβ-40 i Aβ-42 zaadsorbowanych na grafenie w roztworze buforowym PBS zanieczyszczeniu sondy AFM w roztworze soli buforowej, co mogłoby prowadzić do przeszacowania rzeczywistej morfologii oligomerów, a tym samym do zawyżonych wartości wielkości cząstek. Potwierdziliśmy tę hipotezę, ujawniając zanieczyszczenie końcówki AFM podczas obrazowania agregatów amyloidowych w buforze PBS (patrz rys. S2 dla obrazów AFM smug końcówki i efektów podwójnej końcówki w medium buforowym PBS). Aby dokładnie zmierzyć średnicę agregatów oligomerycznych z rozdzielczością pojedynczej cząstki, kontynuowaliśmy pomiary AFM w czystej wodzie i na atomowo czystym grafenie. Rysunek 2 jest wykresem ewolucji średnicy oligomerów w czasie. Każdy punkt na wykresie jest oparty na profilach przekrojowych wyodrębnionych z setek pojedynczych oligomerów w licznych przedziałach czasowych inkubacji począwszy od 0.5 do 110 godzin dla Aβ-40 (czerwona krzywa) i Aβ-42 (zielona krzywa) zaadsorbowanych na interfejsie grafen-woda. Ogólny wzrost średnicy oligomeru jest widoczny na wykresie (Rys. 2) dla obu izoform peptydu, z ogólnie większą średnicą oligomeru dla Aβ-42 w porównaniu do Aβ-40. Nie zaobserwowaliśmy powszechnej obecności agregatów oligomerycznych dla gatunku Aβ-40 po ~80 godzinach inkubacji, podczas gdy w przypadku Aβ-42 agregaty oligomeryczne były nadal obficie obecne nawet po ~110 godzinach inkubacji na podstawie analizy danych AFM (Fig. 4G). Wynik ten sugeruje, że oligomery Aβ-42 o niskiej masie cząsteczkowej utrzymują się dłużej podczas agregacji niż oligomery Aβ-40. Obliczone struktury MD przedstawione w dalszej części pracy (Rys. 6) kwantyfikują dalsze oddziaływania pomiędzy oligomerami Aβ-42 a leżącą pod nimi powierzchnią grafenu. Monitorując zmiany morfologii oligomerów w czasie, wykryliśmy również tworzenie się agregatów fibrylarnych dla obu gatunków Aβ-40 i Aβ-42. Rysunek 3A to topografia AFM rejestrująca pierwsze oznaki pojawiania się agregatów fibrylarnych wzdłuż ścieżki agregacji Aβ-40 po inkubacji roztworu amyloidu przez 30 godzin (zaznaczone czarną strzałką na wykresie na Rys. 2). Te agregaty fibrylarne miały różną wysokość, jak pokazano na profilach przekroju poprzecznego na Fig. 3B wyodrębnionych wzdłuż czarnych linii wskazanych na obrazie wysokości AFM (Fig. 3A). Te agregaty fibrylarne obserwowano razem z agregatami oligomerycznymi (zob. sekcja S2 dla obrazów AFM uzyskanych w innych obszarach tej samej próbki), co wskazuje na obecność mieszaniny fibryli i agregatów oligomerycznych. Na podstawie profili wysokości AFM zmierzonych nad kilkoma pojedynczymi włóknami, jak pokazano na Rys. 3A, obserwujemy, że średnica (wnioskowana na podstawie wysokości) tych obiektów waha się od ~3 do 8 nm, co jest zgodne z wartościami średnicy zmierzonymi za pomocą AFM dla agregatów fibrylarnych Aβ-40 zaadsorbowanych na czystym krzemie (28). W przeszłości te agregaty fibrylarne o morfologii guzkowej występujące podczas wczesnych etapów składania amyloidu zostały sklasyfikowane jako protofibryle, które są intermediatami w ścieżce fibrylacji amyloidu i prekursorami dojrzałych fibryli (22, 27, 36, 40).

Powstawanie protofibryli Aβ-40 (z charakterystyczną strukturą guzkową) po raz pierwszy zaobserwowano po 30 godzinach inkubacji, natomiast powstawanie protofibryli dla Aβ-42 wykryto już po 8 godzinach. Rycina 3C to obraz AFM pokazujący obecność oligomerów wraz z niewielką populacją agregatów fibrylarnych Aβ-42 o różnej wysokości, jak pokazano na rycinie 3D. Ta różnica w szybkości agregacji i wynikających z niej strukturach protofibryli potwierdza, że izoformy Aβ-42 agregują szybciej w roztworze niż Aβ-40. Wraz z agregatami oligomerycznymi i pojedynczymi protofibrylami zaobserwowaliśmy płaskie struktury typu arkusza składające się z lokalnie wyrównanych protofibryli po ~30 godzinach inkubacji Aβ-42 (patrz Fig. 3E i sekcja S3 w celu dalszej charakterystyki AFM protofibryli). Poprzednio, występowanie podobnych bocznie oddziałujących struktur typu arkusza Aβ-42 zostało zgłoszone na graficie rozwiązanym przy użyciu AFM (30). Aby określić ilościowo różnice wysokości dla pierwszych zaobserwowanych protofibryli Aβ-40 i Aβ-42, które pojawiają się w różnych odstępach czasu inkubacji, przeprowadziliśmy analizę statystyczną (Fig. 3F) wysokości ~350 pojedynczych protofibryli dla każdego gatunku. Na podstawie rozkładu wysokości obliczyliśmy średnie wysokości protofibryli wynoszące (3,9 ± 1,6) nm i (5,5 ± 1,5) nm odpowiednio dla Aβ-40 (Ryc. 3F, górny czerwony histogram) i Aβ-42 (Ryc. 3F, dolny zielony histogram). Kolejną zmianą morfologiczną obserwowaną podczas agregacji amyloidu jest tworzenie się dojrzałych fibryli o wydłużonej strukturze. Struktura atomowa dojrzałych fibryli Aβ-40 (10, 43) i Aβ-42 (44, 45) została poznana dzięki mikroskopii krioelektronowej (43, 44) i NMR ciała stałego (45). Jednak różnice w cechach fizycznych, takich jak wysokość i długość fibryli dojrzałych fibryli Aβ-40 i Aβ-42 występujących w różnych odstępach czasu inkubacji, na które mogą wpływać czynniki środowiskowe (46), pozostają do pełnego skatalogowania w warunkach otoczenia.

Pod warunkami stosowanymi w tym badaniu, dojrzałe fibryle zagregowane w roztworze pojawiły się po raz pierwszy w przypadku Aβ-40 po 110 godzinach i po około 90 godzinach czasu inkubacji w przypadku Aβ-42. Figura 4A to wielkoobszarowy obraz wysokości AFM dojrzałych fibryli Aβ-40, które pojawiają się jako zakrzywione (oznaczone czerwonymi strzałkami) i wydłużone pojedyncze fibryle (oznaczone niebieskimi strzałkami). Oprócz pojedynczych fibryli o średniej średnicy (8,5 ± 0,5) nm (średnica fibryli wnioskowana na podstawie śladu wysokości przy założeniu cylindrycznej morfologii fibryli; patrz sekcja S4 dla statystyki wysokości dojrzałych fibryli Aβ-40), obserwujemy również, na podstawie topograficznego i jednocześnie uzyskanego obrazu AFM z kontrastem fazowym (Fig. 4B), obecność połączeń (wskazanych żółtymi strzałkami na Fig. 4A), z których rozgałęziają się pojedyncze fibryle. Nie stwierdziliśmy dominującej obecności agregatów oligomerycznych wraz z dojrzałymi fibrylami Aβ-40, o czym świadczą obrazy wysokości, fazy i nakładania (ryc. 4C). Następnie rozstrzygamy występowanie dojrzałych fibryli Aβ-42 obserwowanych po raz pierwszy po 90 godzinach inkubacji, jak pokazano na wysokorozdzielczym obrazie AFM wysokości (ryc. 4D) i kontrastu fazowego (ryc. 4E). Topologia dojrzałych fibryli obserwowana dla Aβ-42 różni się znacząco od wcześniej obserwowanej topologii dojrzałych fibryli Aβ-40 (Fig. 3A). Dojrzałe fibryle Aβ-42 są ściśle upakowane, kierunkowo wyrównane i występują jako sztywne cylindryczne struktury, bardzo różne od zakrzywionych i izolowanych dojrzałych fibryli Aβ-40. Obserwacja ta jest również potwierdzona przez analizę profilu przekroju poprzecznego (Fig. 4F). W szczególności, zielona linia zaznaczona na ryc. 4D ujawnia ciasno upakowany profil poprzeczny dojrzałych włókien Aβ-42. Na podstawie analizy przekrojów wzdłuż ~200 pojedynczych dojrzałych fibryli obliczamy średnią średnicę dojrzałych fibryli Aβ-42 jako (9,6 ± 0,7) nm (patrz fig. S6A dla statystyk wysokości dojrzałych fibryli Aβ-42).

Bliższa inspekcja danych dotyczących wysokości i kontrastu fazowego obrazu AFM ujawnia istnienie sferycznych agregatów oligomerycznych wraz z dojrzałymi włóknami na tym etapie agregacji Aβ-42. Przeważająca populacja agregatów oligomerycznych jest możliwa do odróżnienia w obrazie kontrastu fazowego (Fig. 4G). Oprócz dostarczenia jakościowych dowodów na istnienie agregatów oligomerycznych w kierunku fazy nasycenia agregacji amyloidu, określiliśmy również ilościowo rozkład wielkości tych agregatów oligomerycznych w oparciu o analizę profilu wysokości przeprowadzoną na ~ 100 indywidualnych agregatach oligomerycznych. Scharakteryzowaliśmy cząstki obecne po pojawieniu się dojrzałych fibryli (90 godzin) do punktu, w którym oligomery nie były już bezpośrednio wykrywane przez AFM (110 godzin). Rysunek 5A przedstawia rozkład średnic agregatów oligomerycznych występujących po 90, 95, 100, 105 i 110 godzinach inkubacji. Dane te identyfikują wąski rozkład średnicy agregatów w zakresie wielkości od ~7 do 9 nm (co odpowiada masie cząsteczkowej 221 ± 80 kDa, która w przybliżeniu odpowiada sferycznemu 50-merowi), które mają tendencję do współistnienia z dojrzałymi fibrylami dla Aβ-42. Gęsto upakowane fibryle pojawiły się podczas końcowych etapów fibrylogenezy Aβ-40 i Aβ-42. Figura 5B to obraz AFM o dużej powierzchni ujawniający nanoskalową topologię łączenia się dojrzałych fibryli Aβ-40 na granicy grafen-woda, gdy roztwór amyloidu inkubowano przez 150 godzin. Dojrzałe agregaty fibrylarne Aβ-40 tworzą się bez kierunkowego ułożenia, co można zaobserwować zarówno na obrazie wysokości, jak i na odpowiadającym mu obrazie kontrastu fazowego (Rys. 5C). Na podstawie danych AFM uzyskanych od początku powstawania dojrzałych fibryli (Fig. 4A) do końcowego stanu zagregowanego (Fig. 5B; należy zauważyć, że topologia blisko upakowanych fibryli nie ulega drastycznej zmianie po 150 godzinach inkubacji), obserwujemy tworzenie się klastrów złożonych z połączonych fibryli. Skupiska te są z kolei połączone przez niewielką populację słabo rozmieszczonych wydłużonych fibryli o średniej wysokości (8,8 ± 1,2) nm. Kolejną wyraźną zmianę morfologiczną wzdłuż szlaku agregacji Aβ-42 zaobserwowano po ~130 godzinach inkubacji, czyli wcześniej niż pojawienie się dojrzałych fibryli Aβ-40 po 110 godzinach. Figura 5D to wielkoobszarowy obraz wysokości dojrzałych fibryli Aβ-42 po czasie inkubacji wynoszącym 150 godzin. Obraz z kontrastem fazowym (Fig. 5E) ujawnia intrygujące szczegóły morfologii gęstych fibryli. Włókna Aβ-42 zostały zaobserwowane jako wyrównane, gdy roztwór amyloidu był inkubowany przez 110 godzin (Fig. 4G). Te wyrównane struktury fibrylarne utrzymywały się przez dłuższy czas inkubacji aż do ~250 godzin bez drastycznych zmian w morfologii fibryli, co sugeruje, że końcowe etapy ścieżki agregacji dla fibryli Aβ-42 są już osiągnięte po około 130 godzinach. Rysunek 5 (F i G) to obraz wysokości i kontrastu fazowego uzyskany na jednym z takich wyrównanych regionów fibrylarnych Aβ-42 po 150 godzinach inkubacji.

Włókna z Aβ-42 pozostają znacząco różne od topologii agregatów fibrylarnych gatunków Aβ-40 inkubowanych przez ten sam okres czasu (Fig. 5B). Obrazy o wysokiej rozdzielczości dodatkowo potwierdzają wyrównanie fibryli o średniej wysokości (9,5 ± 1,1) nm, która jest nieco większa niż średnia wysokość zmierzona dla dojrzałych fibryli Aβ-40. Aby sprawdzić, czy ten efekt wyrównania występuje z powodu silniejszych oddziaływań międzywłóknowych lub montażu wspomaganego przez grafen, osadziliśmy 10 μl peptydu Aβ-42 na czystym szkiełku szklanym (zob. Materiały i metody dotyczące procedury czyszczenia i weryfikacji) przy użyciu tego samego protokołu osadzania i obrazowania stosowanego do badań adsorpcji Aβ-42 na grafenie i obrazowaliśmy w wodzie i podłożu buforowym PBS. Obrazy AFM zarejestrowane dla gatunków Aβ-42 po 150 godzinach inkubacji na granicy faz szkło-woda i szkło-PBS wykazały bardzo podobną morfologię sieci, jaką zaobserwowano na granicy faz grafen-woda (zob. sekcja S5). Zaobserwowano również, że dojrzałe fibryle Aβ-42 wykazywały wyrównanie na szkiełku szklanym podczas obrazowania w roztworze buforowym oraz po spłukaniu i zobrazowaniu powierzchni wodą. Obserwowane ułożenie fibryli na szkle wskazuje, że hydrofilowość i chropowatość powierzchni obrazowania nie są dominującymi czynnikami odpowiedzialnymi za uporządkowanie o dużym zasięgu fibryli Aβ-42. Obserwacja wyrównania fibrylarnego dla dojrzałych fibryli Aβ-42, a nie dla identycznie przygotowanych agregatów fibrylarnych Aβ-40, może być spowodowana dodatkowymi resztami aminokwasowymi obecnymi tylko dla peptydów Aβ-42 (8, 27), które mogłyby promować interakcje międzyfibrylarne. Ostatnio wykazano, że Ala42, nieobecna w Aβ-40, tworzy mostek solny z Lys28, (45) buforując w ten sposób ładunek netto obecny na powierzchni fibryli Aβ-42 (48). Pojawiające się informacje na temat struktury atomowej fibryli Aβ-42 (48) w połączeniu z naszymi obserwacjami AFM średnio dłuższych fibryli Aβ-42 i pomiędzy dwoma centralnymi monomerami (C, czarny). (E) Rozkład maksymalnych wysokości dodekamerów próbkowanych nad powierzchnią grafenu podczas symulacji.

Aby zidentyfikować preferowaną orientację dodekamerów na powierzchni grafenu, obliczyliśmy energie wiązania dodekamer-grafen. Z fig. S9B, stwierdzamy, że obliczone energie wiązania (ΔEbinding) wykazują preferencję orientacyjną zarówno dla Aβ-40 jak i Aβ-42, co odpowiada skłonności dodekamerów wzdłuż arkusza grafenu z dwoma fałdami leżącymi obok siebie, co sprzyja wydłużaniu fibryli. Dekompozycja wartości ΔEbinding (rys. S9B) pokazuje, że różnice pochodzą od polarnych energii wiązania solwatacyjnego. ΔEpolar jest ujemna dla preferowanej orientacji rozsiewania fibryli, ale dodatnia dla dwóch innych płaszczyzn, zarówno w Aβ-40, jak i Aβ-42, wskazując, że woda międzyfazowa oligomer-grafen odgrywa kluczową rolę w stabilizacji tego trybu adsorpcji. Zachęceni powyższymi wynikami, przedłużyliśmy symulacje z tą preferowaną orientacją (oznaczoną jako III) do 0.5 μs. Analizy (o ile nie zaznaczono inaczej) oparte są na ostatnich 200 ns dynamiki swobodnej (rys. S9 pokazuje oś czasu frakcji kontaktów natywnych). Aβ-42 i Aβ-40 przyjmują bardzo podobne tryby adsorpcji z niemal identyczną liczbą kontaktów z grafenem. Dolna wstawka na fig. S9D pokazuje, że reszty Tyr10 w obu dodekamerach Aβ-40 i Aβ-42 próbują stabilnych kontaktów z grafenem bez udziału dwóch dodatkowych reszt C-końcowych w Aβ-42, potwierdzając, że reszty Iso41 i Ala42 zachowują swoje kontakty międzyfoldowe przez cały czas.

Rys. 6A przedstawia reprezentatywne stabilne konformacje (jak wydedukowano z porównań w zakresie orientacji wiązania; zob. fig. S9) 12-merowych struktur Aβ-40 i Aβ-42 na granicy faz grafen-woda w widoku z przodu i z boku. Możemy w przybliżeniu porównać obliczone energie konformacyjne (ryc. 6B) poprzez normalizację na monomer, które przewidują, że dodekamery Aβ-42 są bardziej stabilne (o ~35 kcal/mol) niż Aβ-40, gdy są ułożone w orientacji wydłużania fibryli. Ta obliczona preferencja jest zgodna z szybszą agregacją Aβ-42 obserwowaną w naszym badaniu AFM i we wcześniejszych badaniach agregacji Aβ-42, w połączeniu z utrzymywaniem się oligomerów dla Aβ-42. Główny wkład do ogólnej energii konformacyjnej pochodzi z polarnej energii swobodnej solwatacji dodekameru (fig. S9E), która jest tylko nieznacznie korzystniejsza dla Aβ-42 niż dla Aβ-40. Wkład rozpuszczalnika jest połączony ze znacznie bardziej niekorzystną (dodatnią) elektrostatyczną energią Coulomba (~19 kcal/mol) dla Aβ-40, wskazując, że wewnątrzcząsteczkowe odpychanie ładunków przyczynia się znacząco do ogólnej obserwowanej niestabilności dla Aβ-40. Potencjalnie interesującym odkryciem z naszych symulacji jest widoczna różnica w występowaniu „przedfibrylarnych” wewnątrzrejestrowych wiązań wodorowych (H-bonds) pomiędzy dwoma końcami dodekameru zarówno dla Aβ-40 jak i Aβ-42 na granicy faz grafen-woda (Rys. 6, C i D, oraz tabela S1, patrz również sekcja S6). Niektóre wcześniejsze eksperymenty donosiły, że wzrost fibryli Aβ jest jednokierunkowy (58, 59), podczas gdy inne podkreślały wzrost dwukierunkowy (60, 61). Jednokierunkowy wzrost fibryli przypisano różnicom w wiązaniach H pomiędzy dwoma końcami fibryli wystawionymi na działanie rozpuszczalnika (jeden koniec jest mniej fluktuujący, a więc bardziej zamknięty i stabilniejszy niż drugi) zarówno dla Aβ-40 jak i Aβ-42, na podstawie wcześniejszych badań symulacyjnych MD (62). Nie wiadomo jednak, który koniec faktycznie promuje dodawanie monomerów na fibrylach, chociaż symulacje wykazały, że zamknięte końce mogą rozszerzać się szybciej niż otwarte (63). Z naszej analizy dimerów na dwóch końcach (oznaczonych jako E1 i E2) wystawionych na działanie wody i masowych centralnych dimerów (oznaczonych jako C) dodekameru, stwierdzamy, że liczba wewnątrzrejestrowych wiązań H na jednym końcu (E1) jest znacznie mniejsza niż na drugim końcu (E2) zarówno dla Aβ-40 jak i Aβ-42, identyfikując potencjał do jednokierunkowego wzrostu. Jednakże, różnica 11% (patrz tabela S1 i sekcja S6) jest odnotowana dla najsilniejszych (≥80%) wiązań H pomiędzy E2 i E1 dla Aβ-42, podczas gdy znacznie większa różnica 19% jest odnotowana dla Aβ-40, co sugeruje, że dodekamery Aβ-40 są bardziej otwarte (prawie dwukrotnie bardziej niż dla Aβ-42) na fluktuującym końcu. Dodawanie monomerów na końcu E1 może przebiegać w bardziej uporządkowany sposób dla Aβ-42 niż dla Aβ-40, a ze względu na mniejszą różnicę (o czynnik 2) między dwoma końcami Aβ-42 w porównaniu z tymi w Aβ-40, to przewidywanie modelowania można przetestować w przyszłych eksperymentach AFM z rozdzielaniem w czasie.

Jak wcześniej podkreślono, niedawno zgłoszony mostek solny pomiędzy aminowym łańcuchem bocznym Lys28 i C terminusem Ala42 w strukturze fibryli Aβ-42 odgrywa rolę w stabilizacji fałdu fibryli w kształcie litery S (45). Struktura natywna Aβ-42 posiadająca fałd w kształcie LS użyta w tym badaniu nie posiada pełnego mostka solnego Lys28-Ala42. Aby zidentyfikować oddziaływania, które są specyficzne dla Ala42 w dodecamerach „fibrylopodobnych” Aβ-42, ale nie Aβ-40, obliczyliśmy wewnątrz- i międzyłańcuchowe kontakty reszt (patrz sekcja S6 i rys. S10). Rysunek S10A przedstawia organizację łańcucha w typowym fałdzie dodekamerowym Aβ-42 w kształcie LS, oznaczonym od A do L. Częstotliwości kontaktu ciężkich atomów w kierunku łańcucha dla reszt w odległości 0,5 nm ujawniają, że Ala42 często (>50%) kontaktuje się wewnątrzłańcuchowo z Lys28 (oznaczonym czarnymi okręgami w prawej połowie mapy) i jest to jedyny kontakt wewnątrzkomórkowy, jaki Ala42 nawiązuje w dodekamerze Aβ-42. Ala42 ulega również kontaktom międzyłańcuchowym z Lys28 wzdłuż osi fibryli (zaznaczone czerwonymi okręgami). Oba te wewnątrz- i międzyłańcuchowe kontakty mogą odgrywać rolę w stabilizacji Aβ-42 z udziałem Ala42, który jest nieobecny w Aβ-40. Rysunek S10C przedstawia reprezentatywną strukturę dodekameru, w której łańcuch boczny NH3+ w Lys28 i terminalny COO- w Ala42 pozostają w bliskim sąsiedztwie. Fizyczne znaczenie kontaktów Lys28-Ala42 dla fałdu LS oceniano dalej, obliczając rozkład odległości pomiędzy bocznym łańcuchem aminowym N w Lys28 i karboksylanowym C w Ala42 dla każdego łańcucha w dodekamerze (rys. S10D). Kontakty te osiągają szczyt przy 0,5 nm dla większości łańcuchów, wskazując, że silny kontakt między Lys28 i Ala42 (brak w Aβ-40) może uczynić Aβ-42 bardziej stabilnym w stosunku do dodekamerów Aβ-40 i może odgrywać dodatkową rolę w zapewnieniu silnego wyrównania fibryli Aβ-42, jak zaobserwowano na naszych obrazach AFM. Wreszcie, obliczony rozkład maksymalnej wysokości dodekamerów na powierzchni grafenu z naszych symulacji pokazuje zakres od ~7 do 11 nm dla Aβ-42 (Rys. 6E, czerwona krzywa) z wartością szczytową przy ~8 nm dla modelowanych niesferycznych, warstwowych zespołów dodekamerów. Ogólne wartości wysokości uzyskane dla dodekameru Aβ-42 z symulacji są porównywalne z eksperymentalnie zmierzonymi średnimi wartościami wysokości cząsteczki wynoszącymi (5,8 ± 1,0) nm (zob. rys. S3B, górny zielony wykres statystyczny), co odpowiada masie cząsteczkowej ~55 kDa.