Percorso completo di aggregazione dell’amiloide β (1-40) e (1-42) risolto su un’interfaccia atomicamente pulita

RISULTATI

La figura 1A mostra le strutture precedentemente derivate dalla risonanza magnetica nucleare (NMR) di Aβ-40 monomero e Aβ-42 monomero in soluzione. Le due isoforme differiscono per la lunghezza della sequenza peptidica, Aβ-42 avendo due residui aminoacidici aggiuntivi (Iso41 e Ala42) rispetto a Aβ-40, che risulta nell’aggregazione più veloce osservata di Aβ-42 (38). Le soluzioni Aβ-40 e Aβ-42 sono stati preparati in soluzione tampone PBS (pH 7,4), e per ogni esperimento di imaging AFM, 10 microlitri della soluzione amiloide è stato drop-cast sul grafene atomicamente pulito (vedi Materiali e metodi per i dettagli sulla preparazione e la deposizione di Aβ-40 e Aβ-42 e protocolli di pulizia per il grafene). Cinque minuti dopo la deposizione della soluzione di amiloide, la superficie di grafene è stato lavato con 5 ml di acqua pura per rimuovere la soluzione tampone in eccesso e prevenire eventuali peptidi non legati in soluzione di adsorbire sia sulla superficie o la punta AFM (vedi Materiali e Metodi per i dettagli di imaging AFM nella cella liquida chiusa). Figura 1B mostra un’immagine AFM registrato dopo aver depositato la soluzione Aβ-40 peptide (incubato per ore 0.5) sul grafene epitassiale e imaged in acqua pura. L’immagine in altezza AFM mostra la presenza di particelle singole con distribuzione di dimensioni miste. Per determinare il diametro delle singole particelle, estraiamo il profilo trasversale attraverso le particelle, come mostrato in Fig. 1C. Dal profilo di altezza, osserviamo variazioni nanoscopiche in altezza nella direzione normale alla superficie del grafene per diverse particelle (profilo trasversale segnato da linee bianche in Fig. 1B). La larghezza osservata delle particelle dai dati grezzi AFM è una convoluzione tra la punta AFM e raggio della particella sferica ed è più grande della vera larghezza della particella. Tuttavia, l’altezza misurata non dipende dalla geometria della punta AFM, e come l’altezza è uguale al diametro delle particelle sferiche, è quindi possibile stimare il diametro delle particelle come oligomeri amiloidi (27) e di oggetti cilindrici ad alto rapporto di aspetto come fibrille amiloidi (39). Sulla base di misure simili profilo di altezza estratto lungo centinaia di singole particelle precedentemente attribuito come oligomeri amiloidi (27, 36, 40), la più piccola particella (assumendo una forma sferica) siamo stati in grado di rilevare nello studio attuale per l’isoforma Aβ-40 ha un diametro di ~ 1,65 nm, paragonabile a precedenti rapporti AFM di Aβ-40 peptidi (28). Per stimare il numero di monomeri Aβ nelle particelle misurate nel nostro studio, ci basiamo sul metodo proposto da Erickson (41) per convertire il volume misurato aggregato al peso molecolare, assumendo una forma sferica per le singole particelle Aβ. Sulla base di questa ipotesi, stimiamo che la più piccola particella Aβ-40 di un diametro medio di 1,9 ± 0,25 nm corrisponde a un peso molecolare di ~ 3,0 kDa, che corrisponde approssimativamente a un monomero. Applichiamo lo stesso protocollo di conversione per stimare il peso molecolare di Aβ-42 particelle misurate attraverso AFM.

In seguito, abbiamo confrontato la distribuzione delle dimensioni e la morfologia degli aggregati Aβ-42 con concentrazione identica (5 μM), condizioni tampone (PBS) (pH 7.4), tempo di incubazione (0.5 ore), e le condizioni di deposizione (10-μl volume di Aβ-42 soluzione, 5-min tempo di deposizione, seguita da risciacquo della superficie con 5 ml di acqua pura) come utilizzato per Aβ-40 imaging. Figura 1D è un’immagine topografica AFM di particelle di Aβ-42 classificati come oligomeri da studi precedenti (24, 25). Le particelle Aβ-42 sono presenti in vari diametri come mostrato nel profilo trasversale in Fig. 1E (estratto lungo la linea indicata in Fig. 1D) e sono visibilmente più grandi e più densamente popolati per Aβ-42 che per il Aβ-40 oligomeri (Fig. 1B) incubati per lo stesso periodo di tempo (0,5 ore). Il più piccolo oligomero che siamo stati in grado di misurare con un AFM per l’isoforma Aβ-42 aveva un diametro medio di 3,7 ± 0,2 nm, che corrisponde ad un peso molecolare di ~ 25,0 kDa che corrisponde approssimativamente ad un esamero. Sulla base di analisi del profilo di altezza condotta su ~ 200 singoli oligomeri Aβ-40 e Aβ-42, si estrae un diametro medio di (4.1 ± 1.1) nm per Aβ-40 (Fig. 1F, istogramma superiore barra rossa) e (8.4 ± 2.1) nm per Aβ-42 (Fig. 1F, istogramma inferiore barra verde). I dati qualitativi (immagini topografiche AFM) e quantitativi (distribuzione del diametro dal profilo di altezza) dalla nostra analisi sono coerenti con le osservazioni precedenti che Aβ-42 tende ad aggregare più velocemente di Aβ-40 peptidi (3, 24, 27, 36, 38, 42).

Per giustificare le misure in acqua invece che in tampone PBS, abbiamo confrontato la distribuzione delle dimensioni di Aβ-40 e Aβ-42 oligomeri sia in PBS e acqua pura. Confrontando le distribuzioni statistiche del diametro delle particelle (dedotte dall’analisi della traccia di altezza) per i singoli oligomeri Aβ-40 e Aβ-42 (stesso tempo di incubazione di 1 ora) sia in tampone PBS e acqua pura, i valori di diametro più elevati si trovano per le particelle misurate in tampone PBS che in acqua pura (vedi fig. S3, A e B, per i grafici statistici dettagliati). Qui, attribuiamo l’aumento misurato in diametro medio delle particelle per Aβ-40 e Aβ-42 oligomeri adsorbiti su grafene in soluzione tampone PBS alla contaminazione della sonda AFM in soluzione salina tampone, che potrebbe portare alla sovrastima della morfologia reale degli oligomeri con conseguente gonfiare i valori delle dimensioni delle particelle. Abbiamo confermato questa ipotesi rivelando la contaminazione della punta AFM durante l’imaging degli aggregati amiloidi in tampone PBS (vedi fig. S2 per le immagini AFM di striature punta e gli effetti di punta doppia in mezzo tampone PBS). Per misurare con precisione il diametro degli aggregati oligomerici con risoluzione a singola particella, abbiamo continuato ad eseguire misure AFM in acqua pura e su grafene atomicamente pulito. La figura 2 è un grafico dell’evoluzione del diametro degli oligomeri nel tempo. Ogni punto del grafico è basato su profili trasversali estratti dalle centinaia di singoli oligomeri a numerosi intervalli di tempo di incubazione a partire da 0,5 a 110 ore per Aβ-40 (curva rossa) e Aβ-42 (curva verde) adsorbiti all’interfaccia grafene-acqua. Un aumento generale del diametro dell’oligomero è visibile dal grafico (Fig. 2) per entrambe le isoforme peptidiche con un diametro oligomerico complessivamente più grande per Aβ-42 rispetto a Aβ-40. Non abbiamo osservato la presenza diffusa di aggregati oligomerici per la specie Aβ-40 dopo ~ 80 ore di incubazione, mentre nel caso di Aβ-42, aggregati oligomerici erano ancora presenti abbondantemente anche dopo ~ 110 ore di incubazione in base all’analisi dei dati AFM (Fig. 4G). Questo risultato suggerisce che gli oligomeri a basso peso molecolare di Aβ-42 persistono più a lungo durante l’aggregazione rispetto agli oligomeri di Aβ-40. Le strutture MD calcolate presentate in seguito (Fig. 6) quantificano ulteriormente le interazioni tra gli oligomeri Aβ-42 e la superficie di grafene sottostante. Nel monitorare i cambiamenti nella morfologia degli oligomeri nel tempo, abbiamo anche rilevato la formazione di aggregati fibrillari per entrambe le specie Aβ-40 e Aβ-42. La Figura 3A è una topografia AFM che registra i primi segni della comparsa degli aggregati fibrillari lungo il percorso di aggregazione Aβ-40 dopo la soluzione amiloide è stato incubato per 30 ore (indicato dalla freccia nera nella trama in Fig. 2). Questi aggregati fibrillari erano di altezza variabile come mostrato dai profili trasversali in Fig. 3B estratti lungo le linee nere indicate nell’immagine AFM altezza (Fig. 3A). Questi aggregati fibrillari sono stati osservati insieme agli aggregati oligomerici (vedi sezione S2 per le immagini AFM acquisite su altre aree dello stesso campione) mostrando la presenza di una miscela di fibrille e aggregati oligomerici. Dai profili di altezza AFM misurati su diversi singoli filamenti come mostrato in Fig. 3A, osserviamo il diametro (dedotto dall’altezza) di questi oggetti per variare da ~ 3 a 8 nm, coerente con i valori di diametro misurati con AFM per Aβ-40 aggregati fibrillari adsorbiti su silicio pulito (28). In passato, questi aggregati fibrillari con morfologia nodulare che si verificano durante le prime fasi di assemblaggio amiloide sono stati classificati come protofibrille, che sono intermedi nel percorso di fibrillazione amiloide e precursori di fibrille mature (22, 27, 36, 40).

La formazione di protofibrille di Aβ-40 (con la caratteristica struttura nodulare) è stata osservata dopo 30 ore di incubazione, mentre la formazione di protofibrille per Aβ-42 è stata rilevata dopo solo 8 ore. La Figura 3C è un’immagine AFM che mostra la presenza di oligomeri insieme ad una popolazione minore di aggregati fibrillari Aβ-42 con altezze variabili come mostrato in Fig. 3D. Questa differenza nella velocità di aggregazione e le strutture risultanti protofibrille conferma che Aβ-42 isoforme aggregare più velocemente in soluzione di Aβ-40. Insieme con gli aggregati oligomerici e singoli protofibrille, abbiamo osservato strutture piatte di tipo foglio composto da protofibrille localmente allineati dopo ~ 30 ore di incubazione di Aβ-42 (vedi Fig. 3E e sezione S3 per ulteriori caratterizzazione AFM dei protofibrille). In precedenza, la presenza di simili lateralmente interagenti foglio-tipo Aβ-42 strutture è stato segnalato su grafite risolto utilizzando AFM (30). Per quantificare le differenze di altezza per il primo osservato Aβ-40 e Aβ-42 protofibrille, che appaiono a diversi intervalli di tempo di incubazione, abbiamo eseguito l’analisi statistica (Fig. 3F) delle altezze di ~ 350 protofibrille individuali per ogni specie. Sulla base della distribuzione di altezza, calcoliamo altezze medie protofibrille di (3.9 ± 1.6) nm e (5.5 ± 1.5) nm per Aβ-40 (Fig. 3F, istogramma rosso superiore) e Aβ-42 (Fig. 3F, istogramma verde inferiore), rispettivamente. Il prossimo cambiamento nella morfologia che abbiamo osservato durante l’aggregazione amiloide è la formazione di fibrille mature con la loro struttura allungata. La struttura atomica delle fibrille mature di Aβ-40 (10, 43) e Aβ-42 (44, 45) è nota dalla microscopia crio-elettronica (43, 44) e dalla NMR a stato solido (45). Tuttavia, le differenze nelle caratteristiche fisiche come l’altezza delle fibrille e la lunghezza delle fibrille mature Aβ-40 e Aβ-42 che si verificano a vari intervalli di tempo di incubazione, che possono essere influenzati da fattori ambientali (46), rimangono da catalogare completamente in condizioni ambientali.

Nelle condizioni utilizzate in questo studio, le fibrille mature aggregate in soluzione apparvero per Aβ-40 dopo 110 ore e a circa 90 ore di incubazione per Aβ-42. Figura 4A è una grande area AFM immagine altezza della matura Aβ-40 fibrille che appaiono come curvo (indicato con frecce rosse) e allungato singole fibrille (indicato con frecce blu). Oltre alle singole fibrille con un diametro medio di (8,5 ± 0,5) nm (diametro della fibrilla dedotto dalla traccia di altezza assumendo morfologia cilindrica per le fibrille; vedi sezione S4 per maturo Aβ-40 statistiche altezza fibrille), abbiamo anche osservare, dalla topografica e la fase acquisita simultaneamente AFM immagine di contrasto (Fig. 4B), la presenza di giunzioni (indicato con frecce gialle in Fig. 4A) da cui singole fibrille ramo fuori. Non abbiamo rilevato alcuna presenza prevalente di aggregati oligomerici insieme con le fibrille mature di Aβ-40 come evidenziato dalla altezza, fase, e l’immagine di sovrapposizione (Fig. 4C). Successivamente, risolviamo la presenza di maturo Aβ-42 fibrille prima osservato dopo 90 ore di incubazione come mostrato in alta risoluzione AFM altezza (Fig. 4D) e fase-contrastato immagine (Fig. 4E). La topologia matura fibrilla osservata per Aβ-42 differisce notevolmente dalla topologia precedentemente osservata delle fibrille mature Aβ-40 (Fig. 3A). Le fibrille mature di Aβ-42 sono strettamente imballate, allineate direzionalmente e appaiono come strutture rigide cilindriche molto diverse dalle fibrille mature di Aβ-40 curve e isolate. Questa osservazione è confermata anche dall’analisi del profilo trasversale (Fig. 4F). In particolare, la linea verde indicata in Fig. 4D rivela il profilo laterale strettamente imballato delle fibrille mature Aβ-42. Sulla base di analisi sezionale lungo ~ 200 singole fibrille mature, calcoliamo il diametro medio maturo Aβ-42 fibrille di essere (9,6 ± 0,7) nm (vedi fig. S6A per maturo Aβ-42 statistiche altezza fibrille).

Un’ispezione più approfondita dei dati di altezza e la fase di contrasto AFM immagine rivela l’esistenza di aggregati sferici oligomerici insieme con le fibrille mature in questa fase di Aβ-42 aggregazione. La popolazione prevalente di aggregati oligomerici è distinguibile nell’immagine a contrasto di fase (Fig. 4G). Oltre a fornire prove qualitative per l’esistenza di aggregati oligomerici verso la fase di saturazione dell’assemblea amiloide, abbiamo anche quantificare la distribuzione delle dimensioni di questi aggregati oligomerici basato sull’analisi del profilo di altezza condotta su ~ 100 singoli aggregati oligomerici. Abbiamo caratterizzato le particelle presenti dopo l’insorgenza di fibrille mature (90 ore) fino al punto in cui gli oligomeri non sono stati più direttamente rilevato dal AFM (110 ore). La Figura 5A mostra la distribuzione del diametro degli aggregati oligomerici che si verifica a 90, 95, 100, 105, e 110 ore di incubazione. Questi dati identificano una distribuzione del diametro stretto di aggregati nella gamma di dimensioni di ~ 7 a 9 nm (corrispondente ad un peso molecolare di 221 ± 80 kDa che corrisponde approssimativamente ad una sferica 50-mer) che tendono a coesistere con fibrille mature per Aβ-42. Fibrille densamente confezionate sono apparse durante le fasi finali della fibrillogenesi di Aβ-40 e Aβ-42. La Figura 5B è un’immagine AFM di grande area in altezza che rivela la topologia su scala nanometrica dell’assemblaggio di fibrille mature di Aβ-40 all’interfaccia grafene-acqua quando la soluzione di amiloide è stata incubata per 150 ore. Gli aggregati fibrillari maturi Aβ-40 si formano senza allineamento direzionale, come si può vedere sia dall’altezza che dalla corrispondente immagine a contrasto di fase (Fig. 5C). Sulla base dei dati AFM ottenuti dall’inizio delle fibrille mature (Fig. 4A) fino allo stato aggregato finale (Fig. 5B; si noti che la topologia fibrilla strettamente imballato non subisce un cambiamento drastico oltre 150 ore di incubazione), si osserva la formazione di cluster composti da fibrille fasciate. Questi cluster sono, a loro volta, collegati da una piccola popolazione di fibrille allungate scarsamente distribuite con un’altezza media di (8.8 ± 1.2) nm. Il prossimo distinto cambiamento morfologico lungo il percorso di aggregazione Aβ-42 è stato osservato dopo ~ 130 ore di incubazione, che è prima della comparsa delle fibrille mature Aβ-40 a 110 ore. La figura 5D è un’immagine di altezza di grande superficie delle fibrille mature Aβ-42 dopo un tempo di incubazione di 150 ore. L’immagine a contrasto di fase (Fig. 5E) rivela dettagli intriganti della morfologia densa delle fibrille. Le fibrille Aβ-42 sono state osservate allineate quando la soluzione amiloide è stata incubata per 110 ore (Fig. 4G). Queste strutture fibrillari allineate persistevano per un tempo di incubazione più lungo fino a ~ 250 ore senza drastici cambiamenti nella morfologia delle fibrille, suggerendo che le fasi finali del percorso di aggregazione per le fibrille Aβ-42 è già raggiunto dopo circa 130 ore. Figura 5 (F e G) è l’altezza e l’immagine di contrasto di fase acquisita su una tale regione allineata Aβ-42 fibrillare dopo 150 ore di incubazione.

Le fibrille di Aβ-42 rimangono notevolmente diverse dalla topologia aggregata fibrillare di Aβ-40 specie incubate per lo stesso periodo di tempo (Fig. 5B). Le immagini ad alta risoluzione confermano ulteriormente l’allineamento delle fibrille con un’altezza media di (9,5 ± 1,1) nm che è leggermente superiore all’altezza media misurata per le fibrille mature di Aβ-40. Per verificare se questo effetto di allineamento si verifica a causa di più forti interazioni interfibrillari o grafene-mediato assemblaggio, abbiamo depositato 10 microlitri di Aβ-42 peptide su un vetrino pulito (vedi Materiali e Metodi per la procedura di pulizia e verifica) utilizzando la stessa deposizione e protocollo di imaging utilizzato per Aβ-42 studi di adsorbimento su grafene e imaged in acqua e tampone PBS media. Le immagini AFM registrate per Aβ-42 specie dopo 150 ore di incubazione al vetro-acqua e vetro-PBS interfaccia ha mostrato morfologia di rete molto simile come visto al grafene-acqua interfaccia (vedi sezione S5). Il maturo Aβ-42 fibrille sono stati anche osservati per mostrare l’allineamento sul vetrino quando imaged in soluzione tampone e dopo il risciacquo e l’imaging della superficie con acqua. L’allineamento fibrillare osservato su vetro indica che l’idrofilia e la rugosità della superficie di imaging non sono i fattori dominanti responsabili per il lungo raggio ordinamento del Aβ-42 fibrille. L’osservazione dell’allineamento fibrillare per le fibrille Aβ-42 mature e non per gli aggregati fibrillari Aβ-40 preparati in modo identico può essere dovuto ai residui aminoacidici extra presenti solo per i peptidi Aβ-42 (8, 27) che potrebbero promuovere interazioni interfibrillari. È stato recentemente dimostrato che Ala42, assente in Aβ-40, forma un ponte salino con Lys28, (45) tamponando così la carica netta presente sulla superficie delle fibrille di Aβ-42 (48). Informazioni emergenti sulla struttura atomica delle fibrille Aβ-42 (48) accoppiato con le nostre osservazioni AFM di, in media, più lungo Aβ-42 fibrille e tra i due monomeri centrali (C, nero). (E) Distribuzione delle altezze massime dei dodecameri campionati sopra il foglio di grafene durante le simulazioni.

Per identificare l’orientamento preferito dei dodecameri sulla superficie del grafene, abbiamo calcolato le energie di legame dodecamero-grafene. Dalla fig. S9B, troviamo che le energie di legame calcolate (ΔEbinding) mostrano una preferenza orientativa sia per Aβ-40 che per Aβ-42 corrispondente ad una propensione dei dodecameri lungo il foglio di grafene con le due pieghe adiacenti l’una all’altra, che è favorevole all’allungamento delle fibrille. La decomposizione dei valori di ΔEbinding (fig. S9B) mostra che le differenze hanno origine dalle energie di legame di solvatazione polare. ΔEpolar è negativo per l’orientamento preferito delle fibrille ma positivo per gli altri due piani, sia in Aβ-40 che in Aβ-42, indicando che l’acqua di interfaccia oligomero-grafene gioca un ruolo cruciale nella stabilizzazione di questa modalità di adsorbimento. Incoraggiati dai risultati di cui sopra, abbiamo esteso le simulazioni con questo orientamento preferito (contrassegnato come III) fino a 0,5 μs. Le analisi (se non diversamente specificato) si basano sugli ultimi 200 ns di dinamica libera (fig. S9 mostra la linea temporale della frazione di contatti nativi). Aβ-42 e Aβ-40 adottare modalità di adsorbimento molto simili con un numero quasi identico di contatti al grafene. Il riquadro in basso in fig. S9D mostra che il residuo Tyr10 in entrambi Aβ-40 e Aβ-42 campioni dodecameri contatti stabili con grafene senza alcuna partecipazione dai due residui aggiuntivi C-terminali in Aβ-42, confermando che i residui Iso41 e Ala42 mantenere i loro contatti interfold throughout.

Figura 6A mostra rappresentative conformazioni stabili (come dedotto da confronti su una serie di orientamenti di legame, vedi fig. S9) di Aβ-40 e Aβ-42 12-mer strutture all’interfaccia grafene-acqua in vista frontale e laterale. Possiamo approssimativamente confrontare le energie conformazionali calcolate (Fig. 6B) normalizzando per monomero, che prevedono che Aβ-42 dodecameri sono più stabili (di ~ 35 kcal/mol) di Aβ-40 quando allineati nell’orientamento di allungamento della fibrilla. Questa preferenza calcolata è coerente con l’aggregazione più veloce di Aβ-42 osservata nel nostro studio AFM e in precedenti indagini di aggregazione Aβ-42, insieme alla persistenza di oligomeri per Aβ-42. Il maggior contributo all’energia conformazionale complessiva proviene dall’energia libera di solvatazione polare del dodecamer (fig. S9E), che è solo leggermente più favorevole per Aβ-42 che per Aβ-40. Il contributo del solvente è accoppiato con un’energia elettrostatica di Coulomb notevolmente più sfavorevole (positiva) (~19 kcal/mol) per Aβ-40, indicando che le repulsioni di carica intramolecolare contribuiscono significativamente all’instabilità complessiva osservata per Aβ-40. Una scoperta potenzialmente interessante dalle nostre simulazioni è l’apparente differenza nel verificarsi di “prefibrillare” in-registro legami a idrogeno (H-bond) tra le due estremità del dodecamer sia per Aβ-40 e Aβ-42 all’interfaccia grafene-acqua (Fig. 6, C e D, e tabella S1, e vedere anche la sezione S6). Alcuni esperimenti precedenti hanno riportato che la crescita delle fibrille di Aβ è unidirezionale (58, 59), mentre altri hanno evidenziato una crescita bidirezionale (60, 61). La crescita unidirezionale delle fibrille è stata attribuita alle differenze di H-bonding tra le due estremità delle fibrille esposte al solvente (un’estremità è meno fluttuante e quindi più chiusa e più stabile dell’altra) sia per Aβ-40 che per Aβ-42, da precedenti studi di simulazione MD (62). Tuttavia, non è noto quale estremità promuove effettivamente l’aggiunta di monomeri sulle fibrille, anche se le simulazioni hanno dimostrato che le estremità chiuse possono estendersi più velocemente delle estremità aperte (63). Dalla nostra analisi dei dimeri alle due estremità (designate come E1 ed E2) esposte all’acqua e dei dimeri centrali di massa (indicati come C) del dodecamer, troviamo che il numero di legami H in-registro ad un’estremità (E1) è significativamente inferiore a quello dell’altra estremità (E2) sia per Aβ-40 che Aβ-42, identificando un potenziale di crescita unidirezionale. Tuttavia, una differenza dell’11% (vedi tabella S1 e sezione S6) è registrata per i legami H più forti (≥80%) tra E2 ed E1 per Aβ-42, mentre una differenza significativamente più grande del 19% è registrata per Aβ-40, implicando che i dodecameri di Aβ-40 sono più aperti (quasi il doppio che per Aβ-42) sull’estremità fluttuante. L’aggiunta di monomero sull’estremità E1 può procedere in modo più ordinato per Aβ-42 che per Aβ-40, e a causa della minore differenza (di un fattore 2) tra le due estremità di Aβ-42 rispetto a quelle di Aβ-40, questa previsione modellistica potrebbe essere testata in futuri esperimenti AFM risolti nel tempo.

Come precedentemente evidenziato, il ponte salino recentemente riportato tra la catena laterale amminica di Lys28 e il terminale C di Ala42 nella struttura della fibrilla di Aβ-42 gioca un ruolo nella stabilizzazione della piega a forma di S della fibrilla (45). La struttura nativa di Aβ-42 che ha la piega a forma di S usata in questo studio non ha un ponte salino completo Lys28-Ala42. Per identificare le interazioni che sono specifici per Ala42 in “fibrilla-like” dodecameri di Aβ-42, ma non Aβ-40, abbiamo calcolato intra- e interchain contatti residuo (vedi sezione S6 e fig. S10). La figura S10A mostra l’organizzazione della catena in una tipica piega a forma di LS dodecamer di Aβ-42 contrassegnata da A a L. Le frequenze di contatto catena-atomo pesante dei residui entro una distanza di 0,5 nm rivelano che Ala42 fa frequenti (>50%) contatti intrachain con Lys28 (segnato da cerchi neri nella metà destra della mappa) ed è l’unico contatto intramonomero che Ala42 fa nel dodecamer Aβ-42. Ala42 subisce anche contatti intercatena con Lys28 lungo l’asse della fibrilla (contrassegnato da cerchi rossi). Entrambi questi contatti intra e intercatena potrebbero avere un ruolo nella stabilizzazione di Aβ-42 che coinvolge Ala42, che è assente in Aβ-40. Figura S10C mostra una struttura rappresentativa del dodecamer in cui la catena laterale NH3 + in Lys28 e il COO- terminale in Ala42 stare in stretta vicinanza. La rilevanza fisica dei contatti Lys28-Ala42 per il LS-piega è stata ulteriormente valutata calcolando la distribuzione delle distanze tra la catena laterale amminica N di Lys28 e C carbossilato spina dorsale di Ala42 per ogni catena nel dodecamer (fig. S10D). Questi contatti picco a 0,5 nm per la maggior parte delle catene, indicando che un forte contatto tra Lys28 e Ala42 (mancante in Aβ-40) può rendere Aβ-42 più stabile su Aβ-40 dodecameri e potrebbe svolgere un ruolo supplementare nel garantire un forte allineamento di Aβ-42 fibrille come osservato dalle nostre immagini AFM. Infine, la distribuzione calcolata di altezze massime dodecamer sulla parte superiore del grafene dalle nostre simulazioni mostra una gamma di ~ 7 a 11 nm per Aβ-42 (Fig. 6E, curva rossa) con un picco a ~ 8 nm per il modellato non sferico, assemblee dodecamer stratificato. I valori di altezza complessiva ottenuti per Aβ-42 dodecamer dalle simulazioni è paragonabile ai valori di altezza media delle particelle misurate sperimentalmente di (5,8 ± 1,0) nm (vedi fig. S3B, in alto verde trama statistica), che corrisponde ad un peso molecolare di ~ 55 kDa.